cDNA第二链的合成 引导合成法:获得的双链cDNA能保留完整的5端序列 G 5ppp5 G AAAAAOH 3Ho TTTTTp5' TdTdCTP G ppp 5 G AAAAACccccccoh 3 3 HoCCCCCCC TTTTTp 5 NaoH 3 HoCCCCCCC 退火 3 HoccccCCC TTTTTp 5 5′ pGGGGGGG Klenow dNTPs 3‘ HOCCCCCCC TTTTT 5 AAAAAOh 3
ccDNA DNA第二链的合成 第二链的合成 TdT TdT dCTP dCTP 引导合成法： 引导合成法：获得的双链 获得的双链cDNA cDNA 能保留完整的 能保留完整的5’ 5’端序列 端序列 G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAA AAAAAOHOH 3’ 3’ 3‘ 3‘ HOHO TTTTT TTTTTpp 5’ 5’ G 5‘ 5‘ppp’5 ppp’5 G AAAAA AAAAACCCCCCC CCCCCCCOHOH 3’ 3’ 3‘ 3‘ HOHOCCCCCCC CCCCCCC TTTTT TTTTTpp 5’ 5’ 3‘ 3‘ HOHOCCCCCCC CCCCCCC TTTTT TTTTTpp 5’ 5’ 3‘ 3‘ HOHOCCCCCCC CCCCCCC TTTTT TTTTTpp 5’ 5’ 5‘ 5‘ ppGGGGGGG GGGGGGG 3‘ 3‘ HOHOCCCCCCC CCCCCCC TTTTT TTTTTpp 5’ 5’ 5‘ 5‘ ppGGGGGGG GGGGGGG AAAAA AAAAAOHOH 3’ 3’ NaOH NaOH 退火退火 Klenow Klenow dNTPs dNTPs
CDNA法克隆目的基因的基本战略 双链cDNA的克隆 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中: ●平头末端直接与载体连接,但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾,最好是AT同聚物尾,这样重组 分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 ●加装人工接头引入酶切口,以便插入片段回收
cDNA法克隆目的基因的基本战略 法克隆目的基因的基本战略 双链c 双链cDNA DNA的克隆 的克隆 双链平头的 双链平头的cDNA cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 平头末端直接与载体连接， 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾， 平头两端分别接同聚物尾，最好是 最好是ATAT同聚物尾，这样重组 同聚物尾，这样重组 分子可通过加热局部变性和 分子可通过加热局部变性和S1S1核酸酶处理回收插入片段 核酸酶处理回收插入片段 加装人工接头引入酶切口， 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 以便插入片段回收
CDNA法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 提取细胞总mRNA,合成总CDNA,将之全部克隆,然后 借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时,若使用的是多拷贝载体,则采用菌落原位杂交法 筛选;若使用的是表达型载体,则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序 法分离目的基因的基本程序 完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后 借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后 借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆， 如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等
CDNA法分离目的基因的基本程序 特异分离程序 提取细胞总mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离,回收目标 mRNA,由此合成双链cDNA,然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等
cDNA法分离目的基因的基本程序 法分离目的基因的基本程序 特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标 mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标 mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆 如血红蛋白基因等