鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段,然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子,进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离 随机克隆供体细胞的全基因组DNA 片段，然后通过快速有效的筛选程序从 众多克隆中分离出含有目的基因的目的 重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适 用于原核细菌目的基因的克隆分离
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体DNA的切断 超声波处理:片段长度均一,大小可控,平头末端 全酶切 片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开, 大小不可控 部分酶切:片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载 体;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体 转化受体细胞 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杄菌作 受体细胞;如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)
鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 染色体 染色体DNA DNA的切断 的切断 超声波处理： 超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切： 全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开， 连接，但有可能使目的基因断开， 大小不可控 大小不可控 部分酶切： 部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整 与载体连接 与载体连接 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载 体；如果转化子采用基因产物功能检 体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体 测法筛选，则选择表达型载体 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作 为 转化受体细胞 转化受体细胞 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测 受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达 法筛选，则选择能使目的基因表达 的受体细胞 的受体细胞 筛选含有目的基因的目的重组子 筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立） 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）
鸟枪法操作的改进 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用这一改进方法的前提条件是:目的基因的酶切图谱已知 如果已知目的基因两端的酶切口,可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接,这样可以保证目的基因的完整性,从而提高 重组子中目的重组子的出现频率
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA， 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高 重组子中目的重组子的出现频率 使用特征性限制性内切酶切开染色体 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA DNA
鸟枪法操作的改进 在连接前将DNA片段进行分级分离 例如,已知某目的基因位于1.8kb的Sal 片段中,将染色体DNA用S叫切开,琼 脂糖凝胶电泳分离,用刀片切下相当于 1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块,从此 2.0kb 凝胶块中回收DNA片段,然后与载体进 1.8kb 1.6kb 行拼接
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI 片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼 脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于 1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此 凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进 行拼接 在连接前将DNA片段进行分级分离 片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb
鸟枪法操作的改进 凝胶DNA片段回收技术 冻融法 滤纸法 ●吸附法 氐融点凝胶法 ●溶解法
鸟枪法操作的改进 鸟枪法操作的改进 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 凝胶DNA片段回收技术