淀粉酶活力 (IU/g干培养基) 培养时间(h) 七.思考题 1、测定淀粉酶可米用哪些方法? 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六小型连续发酵实验 实验目的 学习组建微生物连续发酵装置,掌握连续发酵的操作原理和方法,运用所学的连续培养 知识求算发酵过程的稀释率 基本原理 在分批培养中,一次加入所有的培养基,不予补充,不再更换。随着微生物的活跃生长 培养基中营养物质逐渐消耗,有害代谢产物不断积累,细菌的对数生长期不可长时间维持。 如果在培养器中不断补充新鲜营养物质,并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及 代谢产物),理论上讲,对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加 的新菌数相当于流出的老菌数,就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现, 不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料,而且可提高发酵工业的生产 效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向 三、菌种与培养基 1、菌种:大肠杆菌(E.coli) 2、培养基(g/L) 基本培养基:牛肉膏蛋白胨培养基。培养&h后接入发酵培养基培养或4℃冰箱保藏。 发酵培养基:葡萄糖2g/L,Nacl2g/L, NazHPO41.6gL,(NH4)zSO;1.6g调p至 7.2 四、简单连续培养装置
七．思考题 1、测定淀粉酶可采用哪些方法？ 2、比较固态发酵和液态发酵异同点。 实验六 小型连续发酵实验 一．实验目的 学习组建微生物连续发酵装置，掌握连续发酵的操作原理和方法，运用所学的连续培养 知识求算发酵过程的稀释率。 二．基本原理 在分批培养中，一次加入所有的培养基，不予补充，不再更换。随着微生物的活跃生长， 培养基中营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可长时间维持。 如果在培养器中不断补充新鲜营养物质，并及时不断地以同样速度排出培养物(包括菌体及 代谢产物)，理论上讲，对数生长期就可无限延长。只要培养液的流出量能使分裂繁殖增加 的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证培养器中总菌量基本不变。连续培养方法的出现， 不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产 效益和自动化水平。此法已成为当前发酵工业的发展方向。 三、菌种与培养基 1、菌种：大肠杆菌（E. coli）； 2、培养基(g/L) 基本培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。培养 8h 后接入发酵培养基培养或 4℃冰箱保藏。 发酵培养基：葡萄糖 2g/L，Nacl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L， (NH4)2SO4 1.6g/L，调 pH 至 7.2。 四、简单连续培养装置 0 培养时间（h） 淀粉酶活力 （ IU/g 干培养基 ）
图1简单连续培养装置 1一培养基贮槽2一流出液接受器3一蠕动泵4一恒温水浴5一磁力搅拌器6- 培养槽中搅拌转子⑦一温度调节器8一培养基加λ管9一培养液流岀量10输送管 五.测定方法 1.还原糖的测定:3,5一二硝基水杨酸比色法测定 2.蛋白质浓度的测定:考马斯亮蓝染色法 3.大肠杆菌的增殖曲线测定(具体操作步骤见实验四) 大肠杆菌接种于母种培养基,在37℃培养6h,将培养液在300opm离心l0min,倾去 上清液,加入无菌的生理盐水,成均匀液,细胞数为107个/ml,接种于发酵培养基,在相 同条件下进行培养,并每隔一定时间进行取样,用无菌的相同培养液作为CK,将上述菌液 于600nm波长比色(要求消光度在0.3-06间,如果超过用未接种的培养液适当稀释),然 后将培养液在红外线烘箱110-120℃内烘干至恒重,以菌悬液OD值为纵坐标,相对应的 菌体浓度为横坐标,绘制直线,求出斜率 K=生物量OD值 操作步骤 1.制备好的发酵培养液倒入2L的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管,玻璃管上端接内 径3mm、外径5mm的橡皮管。用弹簧夹夹住,灭菌备用。 2.灭菌后冷却至30℃的三角瓶安装于恒温水浴中培养 3.将大肠杆菌培养液以10%的接种量接入三角瓶中,先进行搅拌间歇式培养,若有无 菌空气导管,也可通气搅拌培养 4.将补料用的3L培养基装在廴L的三角瓶中,将送料的橡皮管的一端插入,用棉塞固 定,另一端用油纸包好,灭菌备用。 5.定时取出测定间歇培养的菌液浓度,以求出增殖速度。 →μtdx/x →u(t2-t1)=n(x2/x1) →u=(Inx2-lnx)/(t-t) 6.取下输液用的橡皮管,剥去牛皮纸纸,与蠕动泵进液口相接,将培养器的输液橡皮管
图 1 简单连续培养装置 1－培养基贮槽 2－流出液接受器 3－蠕动泵 4－恒温水浴 5－磁力搅拌器 6－ 培养槽中搅拌转子 7－温度调节器 8－培养基加入管 9－培养液流出量 10－输送管 五．测定方法 1．还原糖的测定：3，5－二硝基水杨酸比色法测定 2．蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝染色法 3．大肠杆菌的增殖曲线测定（具体操作步骤见实验四） 大肠杆菌接种于母种培养基，在 37℃培养 6h，将培养液在 3000rpm 离心 10min，倾去 上清液，加入无菌的生理盐水，成均匀液，细胞数为 107 个/ml，接种于发酵培养基，在相 同条件下进行培养，并每隔一定时间进行取样，用无菌的相同培养液作为 CK，将上述菌液 于 600nm 波长比色（要求消光度在 0.3－0.6 间，如果超过用未接种的培养液适当稀释），然 后将培养液在红外线烘箱 110－120℃内烘干至恒重，以菌悬液 OD 值为纵坐标，相对应的 菌体浓度为横坐标，绘制直线，求出斜率 1/K。 K＝生物量/OD 值 六．操作步骤： 1．制备好的发酵培养液倒入 2L 的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管， 玻璃管上端接内 径 3mm、外径 5mm 的橡皮管。用弹簧夹夹住，灭菌备用。 2．灭菌后冷却至 30℃的三角瓶安装于恒温水浴中培养。 3．将大肠杆菌培养液以 10％的接种量接入三角瓶中，先进行搅拌间歇式培养，若有无 菌空气导管，也可通气搅拌培养。 4．将补料用的 3L 培养基装在 3L 的三角瓶中，将送料的橡皮管的一端插入，用棉塞固 定，另一端用油纸包好，灭菌备用。 5．定时取出测定间歇培养的菌液浓度，以求出增殖速度。 μ=dx/xdt μt=dx/x μ(t2－t1)=ln(x2/x1) μ= (lnx2－ln x1)/ (t2－t1) 6．取下输液用的橡皮管，剥去牛皮纸纸，与蠕动泵进液口相接，将培养器的输液橡皮管