PCR扩增法获得目的基因策略：PCR产物克隆到载体中。普通PCR(PolymeraseChainReaction)反转录PCR（RT-PCR)RACE (Rapid Amplification of cDNAEnd)
二 PCR扩增法获得目的基因 • 策略：PCR产物克隆到载体中。 • 普通PCR（Polymerase Chain Reaction） • 反转录PCR（RT-PCR） • RACE（Rapid Amplification of cDNA End）
PCR扩增法获得自的基达（1）目的基因的直接克隆■适当的引物，PCR基因扩增法可以产生μg级的特异的靶DNA片段，达到这种数量级的基因组DNA可以直接克隆到相应的载体（如质粒或者M13载体，如pMD18-T) 中。(2）CDNA的克隆■利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链
二 PCR扩增法获得目的基因 n （1）目的基因的直接克隆 n 适当的引物，PCR基因扩增法可以产生μg级的特异的靶DNA片段，达到这种 数量级的基因组DNA可以直接克隆到相应的载体（如质粒或者M13载体，如 pMD18-T）中。 n （2）cDNA的克隆 n 利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA 文库。以mRNA为模板，以oligo（dT）为引物，在依赖于RNA的DNA聚合 酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链
PCR扩增法获得目的基因一（1）目的基因的直接克隆pMD18-T&pMD19-TVector的结构pMD18-T&pMD19-TEcoRVT-Cloning SiteVector(2,692 bp)pMD18-TVectorBcaBESTTMSequencing PrimerRVM(GAGCGGATAACAATTTCACACAGGXmalHinc IISmalAccl Ss0B3871laezEcoRISacIKpnlSamHI XbalEcoRVSallPstlSphHindGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigested by EcoR VCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTrSequencingPrimerM13-47...tetagagattatcgtcgacc(T-Cloning Site)pMD19-TVector--agatctctaTtagcagctgg
二 PCR扩增法获得目的基因 n （1）目的基因的直接克隆
PCR扩增法获得自的基因（2）cDNA的克隆定义：以提取的细胞总RNA或纯化的mRNA为模板，反转录获得cDNA，以基因特异性引物扩增获得特异基因的片段SSSSSSmRNA3CDNAB3IIS多宴
二 PCR扩增法获得目的基因 n （2）cDNA的克隆 n 定义：以提取的细胞总RNA或纯化的mRNA为模板，反转录获得cDNA，以 基因特异性引物扩增获得特异基因的片段
PCR扩增法获得自的基因（2）cDNA的克隆总RNA提取：防止RNA的降解和断裂，防止DNA的污染。两步法：先合成cDNA第一链，再进行PCR扩增。合成cDNA引物的选择：（1）随机六聚体引物：非特异，PCR引物赋予特异性，合成的cDNA中96%来源于rRNA。(2)Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。(3)特异性引物：引物与目标RNA互补，PCR扩增特异性高
二 PCR扩增法获得目的基因 n （2）cDNA的克隆 • 总RNA提取： 防止RNA的降解和断裂，防止DNA的污染。 • 两步法：先合成cDNA第一链，再进行PCR扩增。 • 合成cDNA引物的选择：（1） 随机六聚体引物：非特异，PCR引物赋予特 异性，合成的cDNA中96%来源于rRNA。 • （2） Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。 • （3）特异性引物：引物与目标RNA互补，PCR扩增特异性高