10外源基因表达产物的分离纯化 A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 ●针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 ●合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 10 外源基因表达产物的分离纯化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 采用包涵体型战略表达重组蛋白,应先离心回收包涵体; 采用融合型战略表达重组蛋白,一般是胞内可溶性的,拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质,应用低浓度的溶 菌酶处理,然后再用渗透压休克法释放重组蛋白
针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域(pl≤5或pl≥8)的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件,原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内(103-104mol/L); 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的; 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术,在流量、负荷量等参数方面显示岀极大的优越性
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内（10-8 - 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性
多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时,通常需要综合使用多种技术,一般来 说,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: ●应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 ●应首先选择能除去含量最多杂质的方法 ●应尽量选择高效的分离方法 ●应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有 Sephadex和 Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质: 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定,重复性好 价格低廉
合适分离纯化介质的选择 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉