作为报告基因,通常须具有以下几个条件 ①报告基因的表达产物在受体细胞中不存在,即在被转染 的细胞中没有或者无相似的内源性表达产物; ②报告基因的编码产物应该易于检测,相应的有一个简单、 快速、灵敏及经济的检测方法; ③报告基因的核苷酸和相应氨基酸全序列已得到测定,其 编码产物的理化性质、分子结构等也应非常清楚; ④报告蛋白的分析结果应该具有很宽的线性范围,便于分 析启动子活性的大小变化情况; ⑤报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。 Department of Biochemistry Molecular Biology e
Department of Biochemistry & Molecular Biology 11 作为报告基因，通常须具有以下几个条件： ①报告基因的表达产物在受体细胞中不存在，即在被转染 的细胞中没有或者无相似的内源性表达产物； ②报告基因的编码产物应该易于检测，相应的有一个简单、 快速、灵敏及经济的检测方法； ③报告基因的核苷酸和相应氨基酸全序列已得到测定，其 编码产物的理化性质、分子结构等也应非常清楚； ④报告蛋白的分析结果应该具有很宽的线性范围，便于分 析启动子活性的大小变化情况； ⑤报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动
常用的报告基因 氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因:催化将乙酰基从乙 酰辅酶A转移到氡霉素上的反应。CAT来源于原核生 物,具有在哺乳动物中内源性活性极低、蛋白稳定 (在哺乳动物细胞中的半衰期为50h)和具有多种分 析方法等优点,但灵敏度相对低和线性范围窄(2个数 量级)。 β半乳糖苷酶基因(β-ga):来源于大肠杆菌,催 化β-半乳糖苷类物质的水解,基于该酶建立的报告基 因系统具有不使用同位素、有多种灵活的体内及体外 分析方法的优点,其中的化学发光分析法非常灵敏, 具有极宽的线性范围(5~6个数量级),其缺点在于 许多细胞类型都县有南源性的*↓蛛y
Department of Biochemistry & Molecular Biology 12 ▪ 氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因：催化将乙酰基从乙 酰辅酶A转移到氯霉素上的反应。CAT来源于原核生 物，具有在哺乳动物中内源性活性极低、蛋白稳定 （在哺乳动物细胞中的半衰期为50 h）和具有多种分 析方法等优点，但灵敏度相对低和线性范围窄（2个数 量级）。 ▪ β-半乳糖苷酶基因（-gal）：来源于大肠杆菌，催 化β-半乳糖苷类物质的水解，基于该酶建立的报告基 因系统具有不使用同位素、有多种灵活的体内及体外 分析方法的优点，其中的化学发光分析法非常灵敏， 具有极宽的线性范围（5～6个数量级），其缺点在于 许多细胞类型都具有内源性的β-半乳糖苷酶活性。 常用的报告基因
常用的报告基因 荧光素酶基因( Luciferase):最早从萤火虫中克隆 得到。荧光素酶可以催化底物进行转化,同时发射出 生物荧光,通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系, 可以极其灵敏、高效地检测目的基因的启动子活性。 荧光素酶基因作为报告基因,具有哺乳动物细胞内活 性极小、检测速度快、灵敏度高(比CAT基因高30 1000倍)、线性范围宽(4个数量级)、费用低、不 需使用放射性同位素等优点。由于荧光素酶基因的表 达无需翻译后修饰等过程,最适于转录调控的硏究, 因此荧光素酶报告基因在启动子活性的检测方面应用 最为广泛。 Department of Biochemistry Molecular Biology e
Department of Biochemistry & Molecular Biology 13 ▪ 荧光素酶基因（Luciferase）：最早从萤火虫中克隆 得到。荧光素酶可以催化底物进行转化，同时发射出 生物荧光，通过荧光素酶和其底物这一生物发光体系， 可以极其灵敏、高效地检测目的基因的启动子活性。 荧光素酶基因作为报告基因，具有哺乳动物细胞内活 性极小、检测速度快、灵敏度高（比CAT基因高30～ 1000倍）、线性范围宽（4个数量级）、费用低、不 需使用放射性同位素等优点。由于荧光素酶基因的表 达无需翻译后修饰等过程，最适于转录调控的研究， 因此荧光素酶报告基因在启动子活性的检测方面应用 最为广泛。 常用的报告基因
Promoter Fragment 顺式作用元件 结构基因 GCGC---CAAT---TATA 转录起始 增强子 TATA盒 CAAT盒 GC盒 Department of Biochemistry Molecular Biology e
Department of Biochemistry & Molecular Biology 14 Promoter Fragment TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件 结构基因 -GCGC---CAAT---TATA 转录起始
Promoter Fragment 2000 800 100 Department of Biochemistry Molecular Biology e 15
Department of Biochemistry & Molecular Biology 15 Promoter Fragment －2000 －800 －100 －1 √