实验四体积排除色谱(SEC)法测定聚合物的 分子量及分子量分布 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子 量分布密切相关。体积排除色谱( size exclusion chromatography,SEC)是液相色谱 的一个分支,已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合 物的支化度,共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪,可将聚合物按分子量 的大小分级,制备窄分布试样,供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是:快 捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 体积排除色谱在一段时期内常称为凝胶渗透色谱( gel permeation omatography,GPC)、凝胶过滤色谱( gel filtration chromatography,GFC)、凝胶 色谱。从分离机理看,使用体积排除色谱较为确切, 实验目的 1.了解SEC法测定高聚物分子量及分子量分布的原理; 2.掌握 Waters.-510型仪器的操作技术; 3.掌握SEC数据处理方法 、基本原理 体积排除色谱(SEC)分离机理认为在多孔载体(其孔径大小有一定的分布, 并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球)充填的色谱柱里引入聚合 物溶液,用溶剂淋洗,体系是处于扩散平衡的状态。聚合物分子在柱内流动过程中, 不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同,大分子能渗透进去的孔洞数目比小分 子少,有些孔洞即使大小分子都能渗透进去,但大分子能渗透的深度浅。溶质分子 的体积越小渗透进去的几率越大,随着溶剂流动,它在柱中保留的时间越长。如果 分子的尺寸超过载体孔的尺寸时,则完全不能渗透进孔里,只能随着溶剂从载体的 粒间空隙中流过,最先淋出。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时 较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长,于是整个样品即按分子尺 寸由大到小的顺序依次流出。 色谱柱总体积为V,载体骨架体积为Ⅴg,载体中孔洞总体积为V,载体粒间 体积为V0,则 VI=Vg+Vo+Vi Vo和V1之和构成柱内的空间。溶剂分子体积远小于孔的尺寸,在柱内的整个空间
实验四 体积排除色谱（SEC）法测定聚合物的 分子量及分子量分布 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子 量分布密切相关。体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC）是液相色谱 的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合 物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量 的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是：快 捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 体 积 排 除 色 谱 在 一 段 时 期 内 常 称 为 凝 胶 渗 透 色 谱 （ gel permeation chromatography，GPC）、凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）、凝胶 色谱。从分离机理看，使用体积排除色谱较为确切。 一、实验目的： 1．了解 SEC 法测定高聚物分子量及分子量分布的原理； 2．掌握 Waters—510 型仪器的操作技术； 3．掌握 SEC 数据处理方法。 二、基本原理： 体积排除色谱（SEC）分离机理认为在多孔载体（其孔径大小有一定的分布， 并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球）充填的色谱柱里引入聚合 物溶液，用溶剂淋洗，体系是处于扩散平衡的状态。聚合物分子在柱内流动过程中， 不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同，大分子能渗透进去的孔洞数目比小分 子少，有些孔洞即使大小分子都能渗透进去，但大分子能渗透的深度浅。溶质分子 的体积越小渗透进去的几率越大，随着溶剂流动，它在柱中保留的时间越长。如果 分子的尺寸超过载体孔的尺寸时，则完全不能渗透进孔里，只能随着溶剂从载体的 粒间空隙中流过，最先淋出。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时， 较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长，于是整个样品即按分子尺 寸由大到小的顺序依次流出。 色谱柱总体积为 Vt，载体骨架体积为 Vg，载体中孔洞总体积为 Vi，载体粒间 体积为 V0，则 Vt＝Vg＋V0＋Vi V0 和 Vi 之和构成柱内的空间。溶剂分子体积远小于孔的尺寸，在柱内的整个空间
(Vo+V1)活动:高分子的体积若比孔的尺寸大,载体中任何孔均不能进入,只能 在载体粒间流过,其淋出体积是Vo;高分子的体积若足够小,如同溶剂分子尺寸, 所有的载体孔均可以进出,其淋出体积为(Vo+V);高分子的体积是中等大小的尺 寸,它只能在载体孔V的一部分孔中进出,其淋出体积V为 Ve=Vo+KVi K为分配系数,其数值0≤K≤1,与聚合物分子尺寸大小和在填料孔内、外的浓度 比有关。当聚合物分子完全排除时,K=0;在完全渗透时,K=1(见图41)。当K =0时,V=V0;,此处所对应的聚合物 分子量是该色谱柱的渗透极限(PL),商 品SEC仪器的PL常用聚苯乙烯的分子 量表示。聚合物分子量超过PL值时,只 能在Vo以前被淋洗出来,没有分离效 10 logM. 果。 选择渗透 Vo和g对分离作用没有贡献,应设 排除 全部渗透 法减小;V是分离的基础,其值越大柱 子分离效果越好。制备孔容大,能承受 压力,粒度小,又分布均匀,外形规则 (球形)的多孔载体,让其尽可能紧密 保留体积(V) 装填以提高分离能力。柱效的高低,常 图4-1SEC的分离范围 采用理论塔板数N和分离度R来作定性 的描述。测定N的方法可以用小分子物质作出色谱图,从图上求得流出体积V和 峰宽W,以下式计算N值:N=(4Vε/W)2,N值越大,意味着柱子的效率越高。 “1”、“2”代表分子量不同的两种标准样品,V1、V2、W,W2为其淋出体积和 峰宽,分离度R的计算为RN W+1",若R≥1,则完全分离。 上面阐述的SEC分离机理只有在流速很低,溶剂粘度很小,没有吸附,扩散处 于平衡的特殊条件下成立,否则会得出不合理的结果 实验测定聚合物SEC谱图,所得各个级份的分子量测定,有直接法和间接法。 直接法是指SEC仪和粘度计或光散射仪联用:而最常用的间接法则用一系列分子量 已知的单分散的(分子量比较均一)标准样品,求得其各自的淋出体积V,作出logM 对V校正曲线(图4-1) logM=A-BVe (1) 当logM>logM时,曲线与纵轴平行,表明此时的流出体积(V0)和样品的分 子是无关,V即为柱中填料的粒间体积,M就是这种填料的渗透极限。当logM logM时,V对M的依赖变得非常迟钝,没有实用价值。在logM和logM点之间 为一直线,即式(1)表达的校正曲线。式中A、B为常数,与仪器参数、填料和实 验温度、流速、溶剂等操作条件有关,B是曲线斜率,是柱子性能的重要参数,B
（V0＋Vi）活动；高分子的体积若比孔的尺寸大，载体中任何孔均不能进入，只能 在载体粒间流过，其淋出体积是 V0；高分子的体积若足够小，如同溶剂分子尺寸， 所有的载体孔均可以进出，其淋出体积为（V0＋Vi）；高分子的体积是中等大小的尺 寸，它只能在载体孔 Vi 的一部分孔中进出，其淋出体积 Ve为 Ve＝V0＋KVi K 为分配系数，其数值 0≤K≤l，与聚合物分子尺寸大小和在填料孔内、外的浓度 比有关。当聚合物分子完全排除时，K＝0；在完全渗透时，K＝1（见图 4-1）。当 K ＝0 时，Ve＝V0；，此处所对应的聚合物 分子量是该色谱柱的渗透极限（PL），商 品 SEC 仪器的 PL 常用聚苯乙烯的分子 量表示。聚合物分子量超过 PL 值时，只 能在 V0 以前被淋洗出来，没有分离效 果。 V0 和 Vg对分离作用没有贡献，应设 法减小；Vi 是分离的基础，其值越大柱 子分离效果越好。制备孔容大，能承受 压力，粒度小，又分布均匀，外形规则 （球形）的多孔载体，让其尽可能紧密 装填以提高分离能力。柱效的高低，常 采用理论塔板数 N 和分离度 R 来作定性 的描述。测定 N 的方法可以用小分子物质作出色谱图，从图上求得流出体积 Ve 和 峰宽 W，以下式计算 N 值：N＝（4Ve／W）2，N 值越大，意味着柱子的效率越高。 “l”、“2”代表分子量不同的两种标准样品，Ve,1、Ve,2、W1，W2 为其淋出体积和 峰宽，分离度 R 的计算为 ( ,2 ,1 ) 1 2 2 V V e e R W W − = + ，若 R≥1，则完全分离。 上面阐述的 SEC 分离机理只有在流速很低，溶剂粘度很小，没有吸附，扩散处 于平衡的特殊条件下成立，否则会得出不合理的结果。 实验测定聚合物 SEC 谱图，所得各个级份的分子量测定，有直接法和间接法。 直接法是指 SEC 仪和粘度计或光散射仪联用；而最常用的间接法则用一系列分子量 已知的单分散的（分子量比较均一）标准样品，求得其各自的淋出体积 Ve，作出 logM 对 Ve校正曲线（图 4-1）。 logM＝A－BVe -----------------------------------------（1） 当 logM＞logMa时，曲线与纵轴平行，表明此时的流出体积（V0）和样品的分 子是无关，V0 即为柱中填料的粒间体积，Ma就是这种填料的渗透极限。当 logM＜ logMa时，Ve对 M 的依赖变得非常迟钝，没有实用价值。在 logMa和 logMd 点之间 为一直线，即式（1）表达的校正曲线。式中 A、B 为常数，与仪器参数、填料和实 验温度、流速、溶剂等操作条件有关，B 是曲线斜率，是柱子性能的重要参数，B 图 4-1
数值越小,柱子的分辨率越高。 上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物,若待分析样 品的结构不同于标准物质,需用普适校准线。SEC法是按分子尺寸大小分离的,即 淋出体积与分子线团体积有关,利用 Flory的粘度公式 [」M=pR R为分子线团等效球体半径。[ηM是体积量纲,称为流体力学体积。众多的实验中 得出[nM的对数与V有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普 适校准曲线为 logIn=A-Bk (2) 因为在相同的淋洗体积时,有 [uM=[n]2M2 式中下标1和2分别代表标样和试样。它们的Mark- Houwink方程分别为 [n=KM []2=K2M2 K 因此可得 XM.4+ (4) K 或 K 2 将(5)式代入,即得待测试样的标准曲线方程 log m K1,a1 a. A BV=A'-By 1 K K1、K2、a1、a2可以从手册查到,从而由第一种聚合物的MV校正曲线,换算 成第二种聚合物的MVe曲线,即从聚苯乙稀标样作出的MV校正曲线,可以换算 成各种聚合物的校正曲线 三、仪器与样品 Waters-510液相色谱仪、聚苯乙烯样品、四氢呋喃溶剂
数值越小，柱子的分辨率越高。 上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物，若待分析样 品的结构不同于标准物质，需用普适校准线。SEC 法是按分子尺寸大小分离的，即 淋出体积与分子线团体积有关，利用 Flory 的粘度公式： 3 ' R M = ' 3 M R = R 为分子线团等效球体半径。[η]M 是体积量纲，称为流体力学体积。众多的实验中 得出[η]M 的对数与 Ve 有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普 适校准曲线为 ' ' log[ ] M A BV = − e --------------------------------- （2） 因为在相同的淋洗体积时，有 [η]1M1＝[η]2M2 ------------------------------------- （3） 式中下标 1 和 2 分别代表标样和试样。它们的 Mark－Houwink 方程分别为 1 1 1 1 [ ] K M = 2 2 2 2 [ ] K M = 因此可得 1 2 2 1 1 1 1 1 2 1 2 K M M K + + + = ------------------------------ （4） 或 1 1 2 1 2 2 2 1 1 log log log 1 1 K M M K + = + + + ------------------- （5） 将（5）式代入，即得待测试样的标准曲线方程 1 1 1 2 1 2 2 2 1 1 1 log log 1 1 1 e e K M A BV A B V K + + = + − = − + + + K1、K2、α1、α2 可以从手册查到，从而由第一种聚合物的 M-Ve 校正曲线，换算 成第二种聚合物的 M-Ve曲线，即从聚苯乙稀标样作出的 M-Ve校正曲线，可以换算 成各种聚合物的校正曲线。 三、仪器与样品 Waters―510 液相色谱仪、聚苯乙烯样品、四氢呋喃溶剂
四、实验步骤 流动相的准备:重蒸四氢呋喃,经5"砂芯漏斗过滤后备用 2.溶液配制:分别配制5m的聚苯乙烯标样及待测样品的溶液(浓度为0.05-0.3%), 溶解后,经5"砂芯漏斗过滤备用 3. Waters500型液相色谱仪的启动 (1)将经过脱气的四氢呋喃倒人色谱仪的溶剂瓶,色谱仪出口接上回收瓶。 (2)打开泵( Waters-510),从小到大调节流量,最后流速稳定在1.0m/min (3)打开示差折光检测器( Waters-410),同时按下示差检测器面板上的“2 ND FUNO” 和“ PURGE”键,使淋洗液回流通过参比池:进样前再按下“ CLEAR”键,使流 路切换回原位 (4)打开计算机,联机记录 4.进样:待记录的基线稳定后,将进样器把手扳到“LOAD”位(动作要迅速), 用进样注射器吸取样品50μl,并注入进样器(注意排除气泡)。这时将进样器把手 扳到“ INJECT”位(动作要迅速),即进样完成,同时应作进样记录。一样品测试 完成(不再出峰时),可按前面步骤再进其他样品 5.试验结束,应清洗进样器,再依次关机。 五记录及数据处理 GPC谱图的归一化处理 如果仪器和测试条件不变,那么实验得到的谱图可作为试样之间分子量分布的 种直观比较。一般地,应将原始谱图进行“归一化”后再比较。所谓“归一化”, 就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数,以便于比较不同的实验结果和简化计 算。具体作法:确定色谱图的基线后,把色谱峰下的淋出体积等分为20个计算点。 记下这些计算点处的总坐标高度H1(它正比于被测试样的重量浓度)。把所有的H 加和后得到ΣH;(它正比于被测试样的总浓度)。那么,H/ΣH就等于各计算点处 的组分点总试样的重量分数,以H/ΣH对V(或logM)作图就得归一化的GPQ 2.计算M、、M,、M,及分散度d 令W=H/ΣH1 按定义有:Mn=∑MW2;Mn w: M, =(Ew.M: )a: d M M 计算所需的M值可由校正曲线上查得
四、实验步骤 1．流动相的准备：重蒸四氢呋喃，经 5 ＃砂芯漏斗过滤后备用。 2．溶液配制：分别配制 5ml 的聚苯乙烯标样及待测样品的溶液（浓度为 0.05-0.3％）， 溶解后，经 5 ＃砂芯漏斗过滤备用。 3． Waters-500 型液相色谱仪的启动： （1）将经过脱气的四氢呋喃倒人色谱仪的溶剂瓶，色谱仪出口接上回收瓶。 （2）打开泵（Waters-510），从小到大调节流量，最后流速稳定在 1.0ml/min。 （3）打开示差折光检测器（Waters-410）,同时按下示差检测器面板上的“2ND FUNC” 和“PURGE”键，使淋洗液回流通过参比池；进样前再按下“CLEAR”键，使流 路切换回原位。 （4）打开计算机，联机记录。 4．进样：待记录的基线稳定后，将进样器把手扳到“LOAD”位（动作要迅速）， 用进样注射器吸取样品 50μl，并注入进样器（注意排除气泡）。这时将进样器把手 扳到“INJECT”位（动作要迅速），即进样完成，同时应作进样记录。一样品测试 完成（不再出峰时），可按前面步骤再进其他样品。 5． 试验结束，应清洗进样器，再依次关机。 五 记录及数据处理 1．GPC 谱图的归一化处理 如果仪器和测试条件不变，那么实验得到的谱图可作为试样之间分子量分布的 一种直观比较。一般地，应将原始谱图进行“归一化”后再比较。所谓“归一化”， 就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数，以便于比较不同的实验结果和简化计 算。具体作法：确定色谱图的基线后，把色谱峰下的淋出体积等分为 20 个计算点。 记下这些计算点处的总坐标高度 Hi（它正比于被测试样的重量浓度）。把所有的 Hi 加和后得到ΣHi（它正比于被测试样的总浓度）。那么，Hi/ΣHi 就等于各计算点处 的组分点总试样的重量分数，以 Hi/ΣH 对 Ve（或 logM）作图就得归一化的 GPC 图。 2．计算 M w 、 M n 、 M 及分散度 d 令 Wi＝Hi/ΣHi 按定义有： M M W w i i = ； 1 i n i W M M − = ； ( ) 1 2 M W Mi i = ； w n M d M = 计算所需的 Mi 值可由校正曲线上查得
思考题: 色谱柱是如何将高聚物分级的?影响柱效的因素有哪些? 2.本实验中校准曲线的线性关系,在色谱柱重装,或换了柱时能否再使用? 3.SEC法的溶剂选择有什么要求? 4.同样分子量样品支化的和线性的分子那个先流出色谱柱? 参考文献: [1]施良和编,凝胶色谱法,北京,科学出版社,1980 [2]虞志光编,高聚物分子量及其分布的测定,上海,上海科技出版社,1984
思考题： 1．色谱柱是如何将高聚物分级的？影响柱效的因素有哪些？ 2．本实验中校准曲线的线性关系，在色谱柱重装，或换了柱时能否再使用？ 3．SEC 法的溶剂选择有什么要求？ 4．同样分子量样品支化的和线性的分子那个先流出色谱柱？ 参考文献： [1] 施良和编，凝胶色谱法，北京，科学出版社，1980 [2] 虞志光编，高聚物分子量及其分布的测定，上海，上海科技出版社，1984