b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除 外)。 c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到 好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高 温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测 器,最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进 f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。除去溶解在流动相中 的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生 作用 3、流动相流速的选择: 因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不 同的柱效。对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳 流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1m1/min,对于内径 为4.0m柱,流速0.8m1/min为佳。 当选用最佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗 涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙 腈的含量)。 注意: a.由于甲醇廉价,对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈 的场合除外)
21 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除 外)。 c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到 好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高 温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测 器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进 行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中 的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生 作用。 3、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不 同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳 流速。对内径为 4.6mm 的色谱柱，流速一般选择 1ml／min，对于内径 为 4.0mm 柱，流速 0.8ml／min 为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗 涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙 腈的含量)。 注意： a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈 的场合除外)
b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃C的石油醚或提纯后的己 烷作流动相,没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率 大于18兆欧),去离子水及双蒸水中含有酚类杂质,有可能影响分析 结果。 c.含水流动相最奸在实验前配制,尤其是夏天使用缓冲溶液作 为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠,防止细菌生长。 d.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤,除去微粒杂质。 e.使用HPLC级溶剂配制流动相,使用合适的流动相可延长色谱 柱的使用寿命,提高柱性能。 4、柱性能测试 启动液相色谱仪:a、流动相流速设定为1ml/min b、UV检测器波长设定为 254nm。 使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。 记录并计算测试结果。 *参考(标准JB5226-91)液相色谱仪测试用标准色谱柱 高压液相色谱HPLC培训教程(一)I.概论 、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是:溶于流动相( mobile phase)中的各组分 经过固定相时,由于与固定相( stationary phase)发生作用(吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留 时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法
22 b．对于正相柱推荐使用沸程为 30-60℃的石油醚或提纯后的己 烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率 大于 18 兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析 结果。 c．含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作 为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。 d．流动相要求使用 0.45 μm 滤膜过滤，除去微粒杂质。 e．使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱 柱的使用寿命，提高柱性能。 4、柱性能测试： 启动液相色谱仪：a、流动相流速设定为 1ml／min。 b、UV 检测器波长设定为 254nm。 使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。 记录并计算测试结果。 *参考(标准 JB5226-91)液相色谱仪测试用标准色谱柱。 高压液相色谱 HPLC 培训教程(一) I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分 经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、 分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留 时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特( Tset)在1906年研 究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法( Chromatography)因之得 名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液 相色谱法 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下 用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长 (常有几个小时)。高效液相色谱法( High performance liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后 期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区 别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有髙柱效,但会引起高阻力,需用 高压输送流动相,故又称高压液相色谱法( High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱 、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点: 高压一压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。 高速-流速为0.1~10.0ml/min 高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种 高灵敏度一紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点 速度快-通常分析一个样品在15~30min,有些样品甚至在5min内即 可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果
23 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在 1906 年研 究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得 名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液 相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下 用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长 （常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后 期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区 别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用 高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC 的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压-压力可达 150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。 高速-流速为 0.1~10.0 ml/min。 高效-可达 5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 100 种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即 可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果
灵敏度高一紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.lpg 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少,容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分 或做制备 、色谱法分类 按两相的物理状态可分为:气相色谱法(GC)和液相色谱法 (LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可 分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC),其中以GLC应用最广。液 相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同 样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体 色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)为 流动相(常用CO2),因其扩散系数大,能很快达到平衡,故分析时 间短,特别适用于手性化合物的拆分 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱 法(IEC)、排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色 谱法(GPC)和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法 (PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液 分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子 排阻色谱法。 液固色谱法
24 灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分 或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法 (LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可 分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液 相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同 样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体 色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为 流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时 间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱 法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色 谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法 (PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液 分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子 排阻色谱法。 1．液固色谱法
使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定 相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的平 衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离 分子量2001000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物 易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面 而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中 溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱 和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的 区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分 离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很 少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰 基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法 (NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 釆用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为 相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、 异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离 中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等) 反相色谱法
25 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定 相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平 衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 5~10μm。适用于分离 分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物 易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面 而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中 溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱 和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的 区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分 离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很 少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如 C18、C8、氨基柱、氰 基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法 (NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为 相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、 异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离 中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法