3.键合相流失:流动相PH值保持在3^7.5检査柱的方向 4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加:柱恒温 (三)保留时间延长 可能的原因:解决方法 1.流速下降:管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至 钝化柱 3.键合相流失:同前(二)3 4流动相组成变化:同前(二)4 5.温度降低:同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉 可能的原因:解决方法 1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道:更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效:更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏:更换进样器转子 (五)鬼峰 可能的原因:解决方法 1.进样阀残余峰:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物:处理样品 3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)
16 3.键合相流失 : 流动相 PH 值保持在 3~7.5 检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温 (三)保留时间延长 可能的原因 : 解 决 方 法 1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至 钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉 可能的原因 : 解 决 方 法 1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子 (五)鬼峰 可能的原因 : 解 决 方 法 1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱):每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相):通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水 (六)基线噪声 可能的原因:解决方法 1.气泡(尖锐峰):流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声):清洗柱,净化样品,用HLC级试剂 3.检测器灯连续噪声:更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声):采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压 (七)峰拖尾 可能的原因:解决方法 1.柱超载:降低样品量,增加柱直径釆用较髙容量的固定相 2.峰干扰:清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流 动相PH值,钝化样品 4.同前(四)4:同前(四)4 5.同前(四)35.:同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大:连接点降至最低,对所有连接点作合适调 整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降:用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽 可能的原因:解决方法
17 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC 级的水 (六)基线噪声 可能的原因 : 解 决 方 法 1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用 HPLC 级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压 (七)峰拖尾 可能的原因 : 解 决 方 法 1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流 动相 PH 值,钝化样品 4.同前(四)4 : 同前(四)4 5.同前(四)3 5. : 同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调 整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽 可能的原因 : 解 决 方 法
1.进样体积过大:同(四) 2.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大:将连接管径和连接管长度降至最小 9样品过载:进小浓度小体积样品 液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱 柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工 作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 液相色谱柱的安装: 1、液相色谱柱的结构: a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为 7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。 7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35m)连接,中间放置压坏用 于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接, 中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安 装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底 然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连
18 1.进样体积过大 : 同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于 10 点 4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10% 5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载 : 进小浓度小体积样品 液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱 柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工 作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 一、液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构： a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为 7/16 英寸外螺纹，另一端是 3／16 英寸的内螺纹(国内外已规范化)。 7／16 英寸外螺纹与 1／4 英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用 于密封。3／16 英寸的内螺纹与 1／16 英寸(Φ1.57mm)的连接管连接， 中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安 装色谱柱时，用Φ1.57mm 连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底， 然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连
接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5m长或其他固定尺 在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用 于封堵柱填料不被流动相冲岀柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈 钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定 的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂, 以避免腐蚀 b、柱填料: 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分 类是依据填料类型而定 正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种, 其颗粒直径在3--10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合 CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团 (ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒 粒径在3-10μm之间 2,色谱柱的安装: a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱 内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 c、按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管 与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出
19 接管通过压环后露出的管长度应严格控制在 2．5mm 长或其他固定尺 寸)。 在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用 于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 316#不锈 钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定 的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂， 以避免腐蚀。 b、柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分 类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种， 其颗粒直径在 3—10 μm 的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合 —CN，-NH2 等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团 (ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合 C8、C4、C2、苯基等，其颗粒 粒径在 3—10 μm 之间。 2，色谱柱的安装： a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱 内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 c、 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管 与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出
口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3m的不锈 钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设 法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底, 然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧 1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏 液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。 、液相色谱柱的使用: 色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来, 作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用 的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能 测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件 是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性 、样品的前处理: a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸 附的杂质 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到 分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点 a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀 在柱中(或长时间保留在柱中)
20 口与检测器连接。连接管是外径为 1.57mm、内径为 0.1-0.3mm 的不锈 钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设 法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底， 然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧 1／4-1／2 圈，切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏 液现象，请用扳手继续顺时针拧 1／4 圈，直至不漏液为止。 二、液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来， 作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用 的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能 测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件 是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸 附的杂质。 c、使用 0.45μm 的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到 分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀 在柱中(或长时间保留在柱中)