一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液, 常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂 以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现 代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现 已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程 的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8 使用的pH值通常为2.57.5(2^8),太高的pH值会使硅胶溶解,太 低的p值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.510范围 操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高~ 中 流动相极性 中 中~高 组分洗脱次序 极性小先洗 出 极性大先洗出 从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的 界线(如氨基键合固定相) 3.离子交换色谱法
26 一般用非极性固定相（如 C18、C8）；流动相为水或缓冲液， 常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂 以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现 代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现 已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程 的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。但需要注意的是，C18 和 C8 使用的 pH 值通常为 2.5~7.5（2~8），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太 低的 pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在 pH 1.5~10 范围 操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～ 中 中～低 流动相极性 低～ 中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗 出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的 界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法
固定相是离子交换树脂,常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合 物骨架,在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂) 或季氨基(阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上分离原理是树 脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进 行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换 柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关 外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解 离程度,进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大,则离子强 度高,不利于样品的解离,导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4.离子对色谱法 又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支。它是根据被测组分 离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相 中溶解度增大,从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的 酸碱物质 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸 钠、辛烷磺酸钠等。另外髙氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成 很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵 磷酸盐
27 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合 物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂） 或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树 脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进 行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分 离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换 柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关 外，它还受流动相的 pH 值和离子强度影响。pH 值可改变化合物的解 离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强 度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分 离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相 中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的 酸碱物质。 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸 钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成 很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵 磷酸盐
离子对色谱法常用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙 腈-水,水中加入310mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内 进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH 值、离子强度有关。 5.排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的 溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中,滞留时间长;大分子量的化 合物不能进入孔中,直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小 不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物, 如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等 高压液相色谱HPLC培训教程(二)II.基本概念和理论 基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 色谱图( chromatogram)一样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号 时间曲线,又称色谱流出曲线( elution profile)。 基线( base line)一经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测 出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴 噪音( noise)—-基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检 测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移( drift)-基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温 度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗 脱下来也会产生漂移
28 离子对色谱法常用 ODS 柱（即 C18），流动相为甲醇-水或乙 腈-水，水中加入 3~10 mmol/L 的离子对试剂，在一定的 pH 值范围内 进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其 pH 值、离子强度有关。 5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的 溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化 合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小 不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物， 如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。 高压液相色谱 HPLC 培训教程(二) II．基本概念和理论 一、基本概念和术语 1．色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号- 时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测 出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检 测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温 度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗 脱下来也会产生漂移
色谱峰φpeak)-组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出 曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯 Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰( leading peak)和拖尾 峰( tailing peak)。前者少见。 拖尾因子( tailing factor,T),用以衡量色谱峰的对称性。也称为对 称因子( symmetry factor)或不对称因子( asymmetry factor)。《中国 药典》规定T应为0.951.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 峰高( peak height,h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽( peak width,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点 间的距离。W=40 半峰宽( peak width at half- height,Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2 2.3550 标准偏差( standard deviation,σ)-正态分布曲线ⅹ=±1时(拐点) 的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说 明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓 度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。 峰面积φ peak area,A)-峰与峰底所包围的面积。 2.定性参数(保留值) 死时间( dead time,t0)一不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂) 通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间 死体积( dead volume,wo)—-由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固
29 色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出 曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯 Gauss 曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾 峰(tailing peak)。前者少见。 拖尾因子(tailing factor，T)，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对 称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国 药典》规定 T 应为 0.95~1.05。T＜0.95 为前延峰，T＞1.05 为拖尾峰。 峰底-基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点 间的距离。W＝4σ 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2 ＝2.355σ 标准偏差（standard deviation，σ)-正态分布曲线 x＝±1 时（拐点） 的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的 0.607 倍处。标准偏差的大小说 明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓 度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 2．定性参数（保留值） 死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂） 通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。 死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定 相所占据的空间。它包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固
定相颗粒间隙(被流动相占据,Ⅷm)、柱出口管路体积、检测器流动 池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用 为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速) 保留时间( retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现 浓度极大值的时间。 保留体积( retention volume,VR)一-从进样开始到某组分在柱后出现 浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F×tR 调整保留时间( adjusted retention time,t'R)--扣除死时间后的保 留时间。也称折合保留时间( reduced retention time)。在实验条件 (温度、固定相等)一定时,t'R只决定于组分的性质,因此,t’R(或 tR)可用于定性。t'R=tR-t0 调整保留体积( adjusted retention volume,VR)一扣除死体积后的 保留体积。 3.柱效参数 理论塔板数( theoretical plate number,N一用于定量表示色谱柱的 分离效率(简称柱效)。 N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱 长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分 色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加 宽,峰高则逐渐降低 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更 易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰
30 定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动 池体积。其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其它 3 部分只起峰扩展作用。 为防止峰扩展，这 3 部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F 为流速） 保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现 浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)--从进样开始到某组分在柱后出现 浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR 调整保留时间(adjusted retention time，t'R)--扣除死时间后的保 留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件 （温度、固定相等）一定时，t'R 只决定于组分的性质，因此，t'R（或 tR）可用于定性。t'R＝tR－t0 调整保留体积(adjusted retention volume，V'R)--扣除死体积后的 保留体积。 3．柱效参数 理论塔板数(theoretical plate number，N)--用于定量表示色谱柱的 分离效率（简称柱效）。 N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱 长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分 色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加 宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更 易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰