在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响 由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量 级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此,样品进入色 谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测 器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效 降低。为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果, Agilent110OLC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。 毛细管线分类:0.17m内径绿色;0.12m内径一红 色。 PEEK管线:内径 0.13mm;0.18m;0.25mm;0.5mm。 毛细管线优点:柔韧性好 * Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习 惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 4、流动相使用前为什么要脱气? 流动相使用前必须进行脱气处理,以除去其中溶解的气体(如 02),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力 降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无 法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发 生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭 常用的脱气方法比较: 氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效 果较好,但成本高。 加热回流法:效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染
11 在使用 HPLC 时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响， 由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小 4~5 个数量 级，液体流动相的流速也比气相慢 1-2 个数量级。因此，样品进入色 谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测 器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效 降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent 1100LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。 毛细管线分类：0.17mm 内径 ------绿色 ;0.12mm 内径-------红 色。 PEEK 管线：内径 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。 毛细管线优点: 柔韧性好. ***Agilent 公司同时备有 1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习 惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。 4、流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如 O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力 降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无 法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发 生降解而改变柱的分离性能。若用 FLD，可能会造成荧光猝灭。 常用的脱气方法比较： 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效 果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染
抽真空脱气法:易抽走有机相 超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此 法效果最差。 在线真空脱气法: Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术,在线脱 气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种 方法,并适用于多元溶剂体系 5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理? 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器,从而影 响泵的运行,尤其水溶液或磷酸盐缓冲液(PH=4-7)。以下几种方法 可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 A:请严格执行溶剂过滤。 B:请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 C:如果应用许可,可在溶剂中加入0.0001-0.00M的叠氮化钠 D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。 E:避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下,尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水 溶液或磷酸盐缓冲液 堵塞后的处理法方法:将过滤头从组件中取下,在浓硝酸(35%) 中浸泡1h,然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理 6、 Agilent1100LC泵如何维护? Agilent 1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的 流动相,及时合理的维护非常重要。 A:流动相使用前请必须脱气、过滤 B:使用缓冲盐时,要加在线Seal-wash选项
12 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡 10-15min，此 法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC 真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱 气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种 方法，并适用于多元溶剂体系。 5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？ 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影 响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。以下几种方法 可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 A：请严格执行溶剂过滤。 B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 C：如果应用许可，可在溶剂中加入 0.0001---0.001M 的叠氮化钠. D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。 E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水 溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%） 中浸泡 1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。 6、Agilent 1100LC 泵如何维护？ Agilent 1100LC 泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的 流动相，及时合理的维护非常重要。 A：流动相使用前请必须脱气、过滤。 B：使用缓冲盐时，要加在线 Seal-wash 选项
C:关机前,用100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统 10分钟(如甲醇),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱 用适当的溶剂冲洗] D:及时更换 Purge valve内的过滤芯。(当打开 Purge valve时,压 力高于10bar,表明过滤芯已堵)。E:使用合适的密封圈。 、如何选择合适的泵头活塞密封圈? 泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用,但使用正相溶剂 (如正己烷),不适合使用标准活塞密封圈,特别是长时间使用时, 需更换另一种不同的密封圈,我们建议使用聚四氟乙烯密封圈 (p/n0905-14202/pk) **注意:聚四氟乙烯密封圈的压力范围为:0-200bar;建议在泵的 压力限制中,将最大压力设为200bar 8、使用梯度比例发时要注意那些事项? 当盐溶液与有杋溶剂溶液混合时,盐溶液能与有机溶剂溶液完 全混溶,而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点,重力作用使盐颗 粒沉淀下来,通常,阀A接水相/盐溶液,D接有机溶剂,此法连接可 有效使盐回落到盐溶液中,并被溶解。若颠倒过来,盐可能落在有机 溶剂中,出现问题 强烈建议:当使用缓冲盐溶液和有杋溶剂时,推荐将缓冲盐通 道接在A通道上,有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上;定 期用水冲洗所有的通道,以除去阀口上可能出现的盐沉淀 9、在线真空脱气机使用要注意那些事项?
13 C：关机前，用 100%的水冲洗系统 20 分钟，然后用有机溶剂冲洗系统 10 分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱 用适当的溶剂冲洗] D：及时更换 Purge Valve 内的过滤芯。（当打开 Purge Valve 时，压 力高于 10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。 7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？ 泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂 （如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时， 需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。 （p/n0905-1420 2/pk） ***注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0—200bar；建议在泵的 压力限制中，将最大压力设为 200bar。 8、使用梯度比例发时要注意那些事项？ 当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完 全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗 粒沉淀下来，通常，阀 A 接水相/盐溶液，D 接有机溶剂，此法连接可 有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机 溶剂中，出现问题。 强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通 道接在 A 通道上，有机溶剂通道直接接在 A 通道的上方 D 通道上；定 期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。 9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？
般来说, Agilent1100LC的真空脱气机无需过多维护,只 需注意几个注意事项就可以了。 A:第一次使用,要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体;更换不同 类型的溶剂时,要先抽空,再抽满。 B:不用的通道要充满溶剂或密闭起来 10、更换色谱柱时要注意什么事项? 在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响, 由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小45个数量 级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此,样品进入色 谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测 器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效 降低。为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,仪器的流动相 管路连接非常重要,一般 Agilent1100LC在第一次安装时,均有受过 专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只 需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了,一般柱子入口接头为不锈 钢卡套接头,柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头,当完 成第一次安张后,不锈钢卡套已固定死,当接不同的柱子时,要注意 柱子接头处的形状和长度,否则会产生一个非常大的死体积 11、手动进样阀需做那些维护,使用时要注意什么? 对于手动进样器,当使用缓冲溶液后,或者进浓度差异比较大 的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口,同时搬 动进样阀数次,每次数毫升。 注意事项:
14 一般来说，Agilent 1100LC 的真空脱气机无需过多维护，只 需注意几个注意事项就可以了。 A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同 类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。 B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。 10、更换色谱柱时要注意什么事项? 在使用 HPLC 时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响， 由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小 4~5 个数量 级，液体流动相的流速也比气相慢 1-2 个数量级。因此，样品进入色 谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测 器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效 降低 。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相 管路连接非常重要,一般 Agilent 1100LC 在第一次安装时,均有受过 专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只 需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈 钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或 PEEK 管线手拧街头，当完 成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意 柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。 11、手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？ 对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异比较大 的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬 动进样阀数次，每次数毫升。 注意事项：
●安装时六通阀的5,6出口要与注射器在同一水平线上,以 防止虹吸现象的发生,导致进样量的重复性变异。 ●进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。 当样品量少时:进样体积由注射器的进样体积决定,但最大进 样体积要小于1/21l0op体积。 当样品量较多时:进样体积由定量管的体积决定,为保证样品 完全把定量管的流动相置换干净,需注射5-6倍的LOOP体积。 ●要使用专用的液相注射器进样,绝对不可以用气相的注射 器 高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法 诊状 (一)保留时间变化 可能的原因:解决方法 1.柱温变化:柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够:用>25mmol/L的缓冲液 4.柱污染:每天冲洗柱 5.柱内条件变化:稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命:采用保护柱 (二)保留时间缩短 可能的原因:解决方法 1.流速增加:检査泵,重新设定流速 2.样品超载:降低样品量
15 ●安装时六通阀的 5，6 出口要与注射器在同一水平线上，以 防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。 ●进样量的多少要根据定量管的 LOOP 体积决定。 当样品量少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进 样体积 要小于 1/2loop 体积。 当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品 完全把定量管的流动相置换干净，需注射 5—6 倍的 LOOP 体积。 ●要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射 器。 高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法 诊状 (一)保留时间变化 可能的原因 : 解 决 方 法 1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用>25mmol/L 的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱 (二)保留时间缩短 可能的原因 : 解 决 方 法 1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量