注 不同的酶、不同厂家生产的同一种酶的消化条件不同,没有经验时参阅 说明书 星号酶活力 ◆限制酶识别位点与大肠杆菌dam、dcm甲基化作用位点重叠时 dam:表示限制性酶切时dam甲基化作用抑制 dcm:表示限制性酶切时dcm甲基化作用抑制 (一):表示以上两种甲基化作用均无影响 (?):表示甲基化的影响未见报道 许多限制性内切酶在离开识别序列一段距离的地方切割,其切割位点用 括号内的数字来表示。如: HgaI GACGC(5/10) ◆切割消化条件不利于碱基间形成氢键而连接则相反
注： 不同的酶、不同厂家生产的同一种酶的消化条件不同，没有经验时参阅 说明书 星号酶活力 限制酶识别位点与大肠杆菌dam、dcm甲基化作用位点重叠时 dam: 表示限制性酶切时dam甲基化作用抑制 dcm: 表示限制性酶切时dcm甲基化作用抑制 (－): 表示以上两种甲基化作用均无影响 (？): 表示甲基化的影响未见报道 许多限制性内切酶在离开识别序列一段距离的地方切割，其切割位点用 括号内的数字来表示。如：HgaI GACGC(5/10) 切割消化条件不利于碱基间形成氢键而连接则相反
工具酶一连接酶 ◆粘端、平端DNA或切口的连接:T4噬菌体DNA连接酶 5’pA2CC PApApTpTPCPG T3 3 TpG CpTpTpA Ap GCnA 5 Mg2ATP、T4DNA连接酶 5 pap Cp TpTpCpGpT3 3 tpGpCpTpTpApApGpCpAp5 ◆单链DNA或RNA的连接:T噬菌体RNA连接酶 ◆热稳定DNA连接酶
工 具 酶—连接酶 粘端、平端DNA或切口的连接： T4噬菌体DNA连接酶 5’pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp5’ Mg2+ ATP ↓T4DNA连接酶 5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’ 3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’ 单链DNA或RNA的连接：T4噬菌体RNA连接酶 热稳定DNA连接酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶I(全酶) 5’-3’DNA聚合酶活性 切口平移法标记 3’-5’外切酶、5-3’外切酶3’末端标记 K1enow片段 5,-3’DNA聚合酶活性 末端补平、末端标记 3’-5’外切酶 cDNA第二链的合成 T4噬菌体DNA聚合酶外切核酸酶活性比K1enow片段活|体外诱变、末端标记 性高200倍 T7噬菌体DNA聚合酶5’-3’DNA聚合酶活性 体外诱变、末端标记 3’-5′外切酶 热稳定DNA聚合酶 聚合酶活性、5-3’外切酶PCR、DNA序列测定 反转录酶 以RNA为模板合成DNA cDNA的合成 依赖于DN的RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA 合成单链RNA做探针 末端转移酶 在2价阳离子存在时催化dNTP加于cDN末端加同聚尾 DNA分子的3’羟基端 末端标记
DNA聚合酶 DNA 聚合酶I(全酶） 5’-3’DNA聚合酶活性 3’-5’外切酶、5’-3’外切酶 切口平移法标记 3’末端标记 Klenow片段 5’-3’DNA聚合酶活性 3’-5’外切酶 末端补平、末端标记 cDNA第二链的合成 T4噬菌体DNA聚合酶 外切核酸酶活性比Klenow片段活 性高200倍 体外诱变、末端标记 T7噬菌体DNA 聚合酶 5’-3’DNA聚合酶活性 3’-5’外切酶 体外诱变、末端标记 热稳定DNA聚合酶 聚合酶活性、5’-3’外切酶 PCR、DNA序列测定 反转录酶 以RNA为模板合成DNA cDNA的合成 依赖于DNA的RNA 聚合酶 以DNA为模板合成RNA 合成单链RNA做探针 末端转移酶 在2价阳离子存在时催化dNTP加于 DNA分子的3’羟基端 cDNA末端加同聚尾 末端标记
激酶和碱性磷酸酶 T4噬菌体 DNAOH5 多核苷酸激酶5[32p]DNA或 或 RNAOH5 5332pIRNA T ADP [r-32pJATP 二硫苏糖醇 Mg 32P标记DNA5’末端,磷酸化5’末端 5pDNA碱性磷酸酶5 OHDNA 5pRNA 5OHRNA 细菌碱性磷酸酶(AP),牛小肠碱性磷酸酹(CIP) 32P标记前去除5’磷酸,去除DNA片断5’磷酸防止自身环化
激酶和碱性磷酸酶 T4噬菌体 多核苷酸激酶 [r- 32p]ATP 二硫苏糖醇 Mg2+ DNAOH5’ 或RNAOH5’ 5’[32p]DNA或 5’[32p]RNA + ADP 32P标记DNA5’末端，磷酸化5’末端 5’pDNA 5’pRNA 5’OHDNA 5’OHRNA 碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶(BAP)，牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 32P标记前去除5’磷酸，去除DNA片断5’磷酸防止自身环化
载体 自我复制、筛选标记 质粒载体:pUC19、pET21a、pETB1ue-2 具有合适的限制酶切位点 噬菌体载体:λ噬菌体载体 高拷贝数、小分子量、高稳定性 M13噬菌体载体 病毒:pCAT3 克隆载体 人工染色体: 原核 表达载体 真核 思考题 1.载体的特点? 2.都有哪些载体? 3.每种载体在分子生物实验中的功能是什么? 4.载体和宿主细胞之间的关系是什么? 5.如何选择合适的载体?
载 体 自我复制、筛选标记 具有合适的限制酶切位点 高拷贝数、小分子量、高稳定性 质粒载体：pUC19 、pET21a、pETBlue－2 噬菌体载体：λ噬菌体载体 M13噬菌体载体 病毒：pCAT3 克隆载体 人工染色体： { 表达载体{ 原核 真核 思考题 1. 载体的特点？ 2. 都有哪些载体？ 3. 每种载体在分子生物实验中的功能是什么？ 4. 载体和宿主细胞之间的关系是什么？ 5. 如何选择合适的载体？