现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，所以凡含有色氨酸的蛋白质及色氨酸 都有此反应。 ⑤蛋白质黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色 加深呈橙黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。 所以凡含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的蛋白质均有此反应。 讨论、思考题： 1,蛋白质变形作用与变构作用有何本质区别？蛋白质变性后有何特点？ 2.凝胶过滤时，分子量小的蛋白质有较长的保留时间，而在SDS-PGE时，它为何却 后记 “跑”得较快？
31 现紫色环。凡含有吲哚基的化合物都有此反应，所以凡含有色氨酸的蛋白质及色氨酸 都有此反应。 ⑤ 蛋白质黄色反应 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加碱，颜色 加深呈橙黄色。这是因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物。 所以凡含有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的蛋白质均有此反应。 教 学 后 记 讨论、思考题： 1. 蛋白质变形作用与变构作用有何本质区别？蛋白质变性后有何特点？ 2. 凝胶过滤时，分子量小的蛋白质有较长的保留时间，而在 SDS-PAGE 时，它为何却 “跑”得较快？
第三章蛋白质化学 课时 节 第七节 蛋白质分类 第八节蛋白质的分离、纯化与鉴定 1.了解蛋白质的分类 教学目的 上草8会男定有 掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 2。蛋白质分子量的测定方法和原理 3.白质分离纯化的一般原则。 点 沉降系数的含义 教 难 点 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科。生物化学.高等教有出版社，2005,8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教有出版社，2003,5 古练权.生物化学.高等教有出版社，2000,7 徐风彩.基础生物化学.华南理工大学出版社，1999,8
章 第三章 蛋白质化学 课时 2 节 第七节 蛋白质分类 第八节 蛋白质的分离、纯化与鉴定 教 学 目 的 1． 了解蛋白质的分类 2． 掌握蛋白质分子量的测定方法和原理； 3． 掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 教 学 重 点 2． 蛋白质分子量的测定方法和原理； 3． 白质分离纯化的一般原则。 教 学 难 点 沉降系数的含义 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科. 生物化学. 高等教育出版社，2005，8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教育出版社，2003，5 古练权. 生物化学. 高等教育出版社，2000，7 徐凤彩. 基础生物化学.华南理工大学出版社，1999，8
教师授课思路、设问及讲解要点 第七节蛋白质分类 根据分子形状分类 根据蛋白质分子外形的对称程度可将其分为两类。 (一)球状蛋白质 球状蛋白质(lobur proteins)分子比较对称，接近球形或椭球形。溶解度较好 能结晶。大多数蛋白质属于球状蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、酶、抗体等。 (二)纤维蛋白质 纤维蛋白质(fibrous proteins)分子对称性差，类似于细棒状或纤维状。溶解性质 各不相同，大多数不溶于水，如胶原蛋白、角蛋白等。有些则溶于水，如肌球蛋白、 血纤维蛋白原等。 物 二、根据化学组成分类 根据化学组成可将蛋白质分为两类。 (一)简单蛋白质 (二)结合蛋白质(conjugated proteins】 黄 第八节蛋白质的分离、纯化与鉴定 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来 的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组 织细胞的方法有： 1机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、 匀浆器、研体等。 2.渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3.反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要
33 教 学 过 程 教师授课思路、设问及讲解要点 第七节 蛋白质分类 一、根据分子形状分类 根据蛋白质分子外形的对称程度可将其分为两类。 （一）球状蛋白质 球状蛋白质（globular proteins）分子比较对称，接近球形或椭球形。溶解度较好， 能结晶。大多数蛋白质属于球状蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、酶、抗体等。 （二）纤维蛋白质 纤维蛋白质（fibrous proteins）分子对称性差，类似于细棒状或纤维状。溶解性质 各不相同，大多数不溶于水，如胶原蛋白、角蛋白等。有些则溶于水，如肌球蛋白、 血纤维蛋白原等。 二、根据化学组成分类 根据化学组成可将蛋白质分为两类。 （一）简单蛋白质 （二）结合蛋白质（conjugated proteins） 第八节 蛋白质的分离、纯化与鉴定 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来 的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组 织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、 匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要
注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4.超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5.酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度 组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓 冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-l00等），使膜结构破坏，利 于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的 变性。 (三)蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是 根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀 析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在 水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有 机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶 剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分 离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤 维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白 质样品
34 注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的 pH、离子强度、 组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓 冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利 于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的 变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是 根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀 析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在 水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有 机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶 剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分 离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤 维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白 质样品
1.凝胶过滤层析 凝胶过滤层析(gel-filtration chromatography)又称为分子排阻层析或分子筛层析， 它是将葡聚糖凝胶(Sephadex)装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具 有网状结构，不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时， 比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内，而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗 粒之外。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先 被洗脱下来，而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经 的路程长，而且受到来自凝胶内部的阻力也很大，所以蛋白质越小，从柱子上洗脱 来所需时间越长。 由于不同蛋白质的分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同， 洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离的目的（图2-26）。 蛋白质混合物 从柱上度加钱冲液 大分子 小分子 户一集蛋白质的常 大分 小分干 图226凝过滤层析示意图 (a)分子排阻层析示意：)洗靓序，大分子先被洗出 2.纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素(celulos ionexchanger)是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的 表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 (1)羧甲基纤维素(CM-纤维素)在纤维素颗粒上带有羧甲基基团，在中性pH条 件下，羧甲基上的质子可解离下来，而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒
35 1. 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析（gel-filtration chromatography）又称为分子排阻层析或分子筛层析。 它是将葡聚糖凝胶（Sephadex）装入一个柱子中，制成凝胶柱。这种凝胶颗粒具 有网状结构，不同类型凝胶的网孔大小不同。当把蛋白质混合样品加到凝胶柱中时， 比凝胶网孔小的蛋白质可进入网孔内，而大于网孔的分子则不能进入被排阻在凝胶颗 粒之外。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质直接通过凝胶之间的缝隙先 被洗脱下来，而比网孔小的蛋白质可连续不断地进入网孔内。这样的小分子不但流经 的路程长，而且受到来自凝胶内部的阻力也很大，所以蛋白质越小，从柱子上洗脱下 来所需时间越长。 由于不同蛋白质的分子大小不同，进入网孔的程度不同，因此流出的速度不同， 洗脱所用体积及时间不同，从而达到分离的目的（图 2-26）。 2. 纤维素柱层析法 该法是利用蛋白质的酸碱性质作为分离的基础。离子交换纤维素（cellulose ionexchanger）是人工合成的纤维素衍生物，它具有松散的亲水性网状结构，有较大的 表面积，使蛋白质大分子可以自由通过。因此常用于蛋白质的分离。 （1）羧甲基纤维素（CM-纤维素）在纤维素颗粒上带有羧甲基基团。在中性 pH 条 件下，羧甲基上的质子可解离下来，而溶液中带正电荷的蛋白质分子可与纤维素颗粒