上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与 离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 (2)二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素)在中性pH条件下，它含有带正电 荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是 种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有DEAE-纤维素的层析柱时，带正电 荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合 到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定pH和离子强 度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分 离的目的（图2-27）。 纤维颗粒 纤推茶颗粒 0 或哀斯糖 C4,-CH,-94 9 或琼脂精 CH,-c 二乙敏恭乙基纤维装(DEAE-杆维素) 羧甲纤维素(CM-纤维素) (b) ,蛋白质混合液 收样品的管 带负电蒋的蛋白质 69 帝负电荷的蛋白 a梯度 带正电荷的蛋白质 6 0。 / 洗膜修积+ 图2-27纤维素柱层析示意图 (a)DEAE纤维素和CM纤维素的结构：(b)离子交袭纤维素层析示意：《c)离子交换纤维索层析分离图语
36 上的羧甲基负电荷结合。可交换的基团带正电，因此是一种阳离子交换剂。蛋白质与 离子交换纤维素之间结合能力的大小取决于彼此间相反电荷基团之间静电吸引。 （2）二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素） 在中性 pH 条件下，它含有带正电 荷的基团，可与溶液中的带负电荷的蛋白质结合，可交换的基团带负电荷，因此是一 种阴离子交换剂。当某一蛋白质混合溶液通过装有 DEAE-纤维素的层析柱时，带正电 荷的蛋白质不能结合而随着洗脱液的流动先被洗脱下来。带负电荷的蛋白质将被结合 到柱上。结合力取决于彼此相反电荷基团间的静电吸引。然后选用一定 pH 和离子强 度的缓冲液进行洗脱，改变蛋白质分子所带的静电荷，依次从层析柱流出达到相互分 离的目的（图 2-27）
3.亲和层析 亲和层析(affinity chromatography)分离技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团 具有专一性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为 配基或配体(ligand)。亲和层析是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法。例如醇对忙 的底物具有特殊的亲和力：抗原和抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A) 的分离纯化为例，由于该蛋白对葡萄糖有专一性亲和吸附，因此可把葡萄糖通过适当 的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面上。为了防止载体表面的空间 位阻影响待分离的蛋白质大分子与其配基的结合，在配基和载体之间往往插入一段所 谓的连接臂（或称为间隔臂，spacer arm),使配体与载体之间保持足够的距离。如下所 示： G 载体 配基 连接臂 将这种多糖颗粒装入一定规格的玻璃管中就制成了一根亲和层析柱。当含有伴刀 豆球蛋白的提取液加到层析柱的上部，并沿柱向下流过时，待纯化的蛋白质与其特异 性配基结合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出。 然后采用一定的洗脱条件，如浓的葡萄糖溶液进行洗脱，即可把该蛋白质洗脱下来， 达到与其它蛋白质分离的目的。 三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 (一)凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量 的原理如“分离纯化方法”中所述。 一定型号的凝胶颗粒上具有一定大 小的孔隙，只允许较小的分子进入胶 粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶 粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗 脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先 分子量对数 被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋 图2-29蛋白质的分子量与洗脱体积之间的关系 白质也按分子量大小而先后被洗脱 的一外水体积 一洗规体积
37 3. 亲和层析 亲和层析（affinity chromatography）分离技术是根据许多蛋白质对特定的化学基团 具有专一性结合的原理。这些能被生物大分子如蛋白质所识别并与之结合的基团称为 配基或配体（ligand）。亲和层析是一种极有效的分离纯化蛋白质的方法。例如酶对它 的底物具有特殊的亲和力；抗原和抗体互为配基。以伴刀豆球蛋白 A（concanavalin A） 的分离纯化为例，由于该蛋白对葡萄糖有专一性亲和吸附，因此可把葡萄糖通过适当 的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体表面上。为了防止载体表面的空间 位阻影响待分离的蛋白质大分子与其配基的结合，在配基和载体之间往往插入一段所 谓的连接臂（或称为间隔臂，spacer arm），使配体与载体之间保持足够的距离。如下所 示： 将这种多糖颗粒装入一定规格的玻璃管中就制成了一根亲和层析柱。当含有伴刀 豆球蛋白的提取液加到层析柱的上部，并沿柱向下流过时，待纯化的蛋白质与其特异 性配基结合而被吸附到柱上，其他蛋白因不能与葡萄糖配基结合将通过柱子而流出。 然后采用一定的洗脱条件，如浓的葡萄糖溶液进行洗脱，即可把该蛋白质洗脱下来， 达到与其它蛋白质分离的目的。 三、蛋白质分子量的测定 蛋白质分子量测定的方法很多，目前常用的方法有以下几种。 （一）凝胶过滤法 凝胶过滤法测定蛋白质分子量 的原理如“分离纯化方法”中所述。 一定型号的凝胶颗粒上具有一定大 小的孔隙，只允许较小的分子进入胶 粒，而大于孔隙的分子则不能进入胶 粒而被排阻在胶粒外面。用洗脱液洗 脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先 被洗脱下来，随后能够进入颗粒的蛋 白质也按分子量大小而先后被洗脱
下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋 白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用 几种己知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分 子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析， 根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来（图 2-29). (二)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了十二烷基硫 酸钠(sodiumdodecyl sulfate,SDS)。SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解 离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS(一般加入量为0.1%)后，SDS与蛋白质分子 结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的 电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合 物的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成 正比。这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白 质分子量的大小。进行凝胶电泳时，常常用一种染料作前沿物质，蛋白质分子在电泳 中的移动距离和前沿物质移动的距离之比值称为相对迁移率，相对迁移率和分子质量 的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲 线。将未知蛋白质在同样条件下电泳，根据测得的样品相对迁移率，从标准曲线上便 可查出其分子量。 样品孔 阴极 u 层线冲 入样品 m心山心心心 胶 下层烟冲液 图2-30聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 ()聚丙烯酰质凝胶电泳示意：（间）池泳分高国请：（®）蛋白质分子量对数与其迁移率的关系 本节课所讲的主要内容： 2。本节课的学习重要和难点：蛋白质分子量的测定方法和原理：蛋白质分离纯化的 般原则。 记
38 下来，分子量越小的越后被洗脱下来。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋 白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用 几种已知分子量的蛋白质为标准进行层析分析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分 子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行层析分析， 根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量来（图 2-29）。 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同的是在样品及电泳缓冲液中加入了十二烷基硫 酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）。SDS 是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解 离成亚基。当蛋白质样品中加入 SDS（一般加入量为 0.1％）后，SDS 与蛋白质分子 结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，这些电荷量远远超过蛋白质分子原来所带的 电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差异。所有结合 SDS 的蛋白质-SDS 复合 物的形状近似于长的椭园棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成 正比。这样，消除了蛋白质之间原有的电荷和形状的差异，电泳的速度只取决于蛋白 质分子量的大小。进行凝胶电泳时，常常用一种染料作前沿物质，蛋白质分子在电泳 中的移动距离和前沿物质移动的距离之比值称为相对迁移率，相对迁移率和分子质量 的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲 线。将未知蛋白质在同样条件下电泳，根据测得的样品相对迁移率，从标准曲线上便 可查出其分子量。 教 学 后 记 1．本节课所讲的主要内容； 2．本节课的学习重要和难点：蛋白质分子量的测定方法和原理；蛋白质分离纯化的一 般原则
章 第四章酶化学 课时 3 节 酶的命名与分类 第三节酶的组成与结构 第四节酶的作用机理 1 了解酶的化学本质，催化作用特点，分类与命名。 教 2 熟悉酶的组成（各定义，双成分酶中各成分的含义） 3. 掌握酶催化作用机理的有关概念：活性中心，必需基因，酶原激活专一行及有 关学说（诱导契合学说），高效性及有关理论（活化能，酶催化高性因素等）。 步 1.酶催化作用机理的有关概念 学 重 点 教 酶催化作用机理的有关概念（高效性及有关理论） 学 难 点 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科.生物化学.高等教有出版社，2005,8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教育出版社，2003,5 古练权.生物化学.高等教育出版社，2000,7 徐凤彩.基础生物化学.华南理工大学出版社，1999,8
章 第四章 酶化学 课时 3 节 第一节 酶的概念 第二节 酶的命名与分类 第三节 酶的组成与结构 第四节 酶的作用机理 教 学 目 的 1. 了解酶的化学本质，催化作用特点，分类与命名。 2. 熟悉酶的组成（各定义，双成分酶中各成分的含义） 3. 掌握酶催化作用机理的有关概念：活性中心，必需基因，酶原激活专一行及有 关学说（诱导契合学说），高效性及有关理论（活化能，酶催化高性因素等）。 教 学 重 点 1． 酶催化作用机理的有关概念 教 学 难 点 酶催化作用机理的有关概念（高效性及有关理论） 相关素材（参考资料、指导学生阅读材料等）： 杨志敏，蒋立科. 生物化学. 高等教育出版社，2005，8 王镜岩，沈同.生物化学（第三版）.高等教育出版社，2003，5 古练权. 生物化学. 高等教育出版社，2000，7 徐凤彩. 基础生物化学.华南理工大学出版社，1999，8
教师授课思路、设问及讲解要点 第一节酶的概念 一、酶是生物催化剂 新陈代谢由一系列化学反应完成，同样的化学反应，体外速度很慢，体内很快。 活细胞是个温和的环境，之所以能顺利和迅速地进行一系列化学反应，是由于存 在一系列特殊物质一一酶(E)。 (一)酶的定义 酶是由活细胞产生的，在细胞内、外均有催化作用的特殊蛋白质或其他物质。 (二)酶的化学本质 酶的本质是蛋白质的概念受到了一次巨大的冲击。最近又有人报道，DNA也有催 北活性。因此，对酶的本质问题又将引起新的争论，引进更新的内容 数 二、E的作用特点 (一)与一般催化剂的相同点 学 1,反应前后，质与量不变，用量少 必 2.缩短到达平衡的时间，不改变平衡点 冬 3.只能催化本来能进行的反应，即热力学上允许的反应。 4.降低反应活化能 (二)与一般催化剂的不同点 1、高效 酶促反应的速度比非酶促反应高108~1020倍，比一般催化剂高10~10倍。 2、高度专一酶对底物有严格的选择性 3、酶易失活，要求温和条件 绝大多数酶是蛋白质，凡能使蛋白质变性的因素都能使酶丧失活性。 4、酶的活性可受到调节、控制 通过多种机制和形式对酶活性进行调节和控制，使代谢活动有条不素地进行。 5、酶催化常需辅助因子。 三、酶的分布 酶分布在所有的细胞和组织中，相对隔离，各自发挥作用。酶在生活细胞中产生 大部分酶在细胞内起催化作用，称为胞内酶。有些酶被分泌到细胞外发挥作用，这类
40 教 学 过 程 教师授课思路、设问及讲解要点 第一节 酶的概念 一、酶是生物催化剂 新陈代谢由一系列化学反应完成，同样的化学反应，体外速度很慢，体内很快。 活细胞是个温和的环境，之所以能顺利和迅速地进行一系列化学反应，是由于存 在一系列特殊物质——酶（E）。 （一）酶的定义 酶是由活细胞产生的，在细胞内、外均有催化作用的特殊蛋白质或其他物质。 （二）酶的化学本质 酶的本质是蛋白质的概念受到了一次巨大的冲击。最近又有人报道，DNA 也有催 化活性。因此，对酶的本质问题又将引起新的争论，引进更新的内容。 二、E 的作用特点 （一） 与一般催化剂的相同点 1．反应前后，质与量不变，用量少 2．缩短到达平衡的时间，不改变平衡点 3．只能催化本来能进行的反应，即热力学上允许的反应。 4．降低反应活化能 （二）与一般催化剂的不同点 1、高效 酶促反应的速度比非酶促反应高 108～1020 倍，比一般催化剂高 10 6～10 13 倍。 2、高度专一 酶对底物有严格的选择性。 3、酶易失活，要求温和条件 绝大多数酶是蛋白质，凡能使蛋白质变性的因素都能使酶丧失活性。 4、酶的活性可受到调节、控制。 通过多种机制和形式对酶活性进行调节和控制，使代谢活动有条不紊地进行。 5、酶催化常需辅助因子。 三、酶的分布 酶分布在所有的细胞和组织中，相对隔离，各自发挥作用。酶在生活细胞中产生， 大部分酶在细胞内起催化作用，称为胞内酶。有些酶被分泌到细胞外发挥作用，这类