以上各成份混合高热溶解后,即可调节pH,后续步骤同上 (二〕普通琼脂培养基:普通琼脂是常用的固体培养基。琼脂本身无营养,只是用以改变肉 汤的物理性状。它是一种赋形剂,在100℃时融化,40℃左右凝固,通常肉汤中加入2%3% 琼脂,融化后能在室温下凝固成固体,即为固体培养基。 【成分】琼脂 肉汤培养基100m1 【方法】 1.取已制备好的肉汤培养基100m1,置于三角烧瓶中,加琼脂2-3g加热溶化。 2.趁热校p至7.4-7.6 3.未凝前分装于试管中(可装于大、中不同号的试管,以备作琼脂斜面及平板用),加 棉塞或塑料塞,高压蒸气灭菌。 4.灭菌后将中试管(4-5m1)斜置待凝后即成普通琼脂斜面。大试管中的培养基(约16m1) 称为琼脂高层,在琼脂未凝前以无菌操作注入无菌平皿内凝固后即是普通琼脂平板。倾注平 板时必须严格无菌操作,此外,琼脂的温度不可过高,约在55℃为宜,温度过高则平皿内 凝固水过多,易引致污染,过低则琼脂凝固使培养基表面不平。 5.4℃冰箱保存备用。 三)半固体培养基:用于观察有鞭毛细菌的运动能力。 【成分】琼脂 肉汤培养基 100ml 【方法】于100m1肉汤培养基中加入0.5g琼脂,加热融化后,校正pH7.4-7.6。分 装于小试管中(每管约2m1),高压蒸气灭菌。灭菌后将试管直立,待冷凝后即成半固体培 养基。4℃冰箱保存备用。 (四)血液琼脂培养基及巧克力平板:用于营养要求较高的细菌的分离培养,如链球菌和奈 瑟菌。同时,根据溶血现象可以作为鉴别培养基使用。 【成份】普通琼脂培养基 100m1 无菌脱纤维兔(或羊)血 【方法】 1.将已灭菌的普通琼脂培养基加热融化,并冷至55℃左右。 2.按无菌操作法加脱纤维兔血或羊血于琼脂培养基内混匀(注意勿产生气泡),然后分 装于灭菌试管或平皿中,制成血液琼脂斜面或平板,放4℃冰箱保存备用 3.将普通琼脂培养基加热融化,温度降至80℃左右时,加入全血混匀,制备成平板, 冷却凝固后血红蛋白变性呈巧克力色,即为巧克力平板 五〕克氏双糖铁培养基:用于肠道细菌鉴定,比较细菌分解葡萄糖,乳糖产酸产气及硫化 氢形成 【成份】上层:蛋白胨1g,琼脂1.6g牛肉膏03g,乳糖1g,氯化钠0.5g,蒸馏水100 11
11 以上各成份混合高热溶解后，即可调节 pH，后续步骤同上。 （二）普通琼脂培养基：普通琼脂是常用的固体培养基。琼脂本身无营养，只是用以改变肉 汤的物理性状。它是一种赋形剂，在 100℃时融化，40℃左右凝固，通常肉汤中加入 2%~3% 琼脂，融化后能在室温下凝固成固体，即为固体培养基。 【成分】琼脂 2-3g 肉汤培养基 lOO ml 【方法】 1．取已制备好的肉汤培养基 100ml，置于三角烧瓶中，加琼脂 2-3g 加热溶化。 2．趁热校 pH 至 7.4-7.6。 3．未凝前分装于试管中(可装于大、中不同号的试管，以备作琼脂斜面及平板用)，加 棉塞或塑料塞，高压蒸气灭菌。 4．灭菌后将中试管(4-5 m1)斜置待凝后即成普通琼脂斜面。大试管中的培养基(约 16 m1) 称为琼脂高层，在琼脂未凝前以无菌操作注入无菌平皿内凝固后即是普通琼脂平板。倾注平 板时必须严格无菌操作，此外，琼脂的温度不可过高，约在 55 ℃为宜，温度过高则平皿内 凝固水过多，易引致污染，过低则琼脂凝固使培养基表面不平。 5． 4 ℃冰箱保存备用。 (三) 半固体培养基：用于观察有鞭毛细菌的运动能力。 【成分】 琼脂 0.5g 肉汤培养基 lOO ml 【方法】 于 100ml 肉汤培养基中加入 0.5g 琼脂，加热融化后，校正 pH 7.4-7.6。分 装于小试管中(每管约 2 m1)，高压蒸气灭菌。灭菌后将试管直立，待冷凝后即成半固体培 养基。4 ℃冰箱保存备用。 (四) 血液琼脂培养基及巧克力平板：用于营养要求较高的细菌的分离培养，如链球菌和奈 瑟菌。同时，根据溶血现象可以作为鉴别培养基使用。 【成份】普通琼脂培养基 lOO ml 无菌脱纤维兔(或羊)血 lO ml 【方法】 1．将已灭菌的普通琼脂培养基加热融化，并冷至 55 ℃左右。 2．按无菌操作法加脱纤维兔血或羊血于琼脂培养基内混匀(注意勿产生气泡)，然后分 装于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或平板，放 4 ℃冰箱保存备用。 3. 将普通琼脂培养基加热融化，温度降至 80 ℃左右时，加入全血混匀，制备成平板， 冷却凝固后血红蛋白变性呈巧克力色，即为巧克力平板。 （五）克氏双糖铁培养基：用于肠道细菌鉴定，比较细菌分解葡萄糖，乳糖产酸产气及硫化 氢形成。 【成份】上层：蛋白胨 1 g, 琼脂 1.6 g, 牛肉膏 0.3 g, 乳糖 1 g, 氯化钠 0.5 g, 蒸馏水 100
ml,0.4%酚红06ml,硫代硫酸钠002g,无水硫酸亚铁0.02g 下层:蛋白胨1g,琼脂63g,牛肉膏0.3g,葡萄糖0.1g,氯化钠0.5g,蒸馏 水100m,04%酚红0.6ml 【方法】 1.除琼脂和酚红外,将上层或下层的其余各成份分别溶解于蒸馏水,校正pH为76; 2.加入琼脂加热融化,再加入酚红溶液摇匀,分层分装试管,高压灭菌121℃20min, 放4℃冰箱保存备用。 (六)麦康凯琼脂糖培养基:常用的选择培养基,用于肠道致病菌的分离与鉴定。 【成份】蛋白胨 氯化钠 胆盐 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 乳糖 0 1.0%中性红溶液5ml 【方法】 1.上述成分除乳糖、中性红和琼脂外,溶解于蒸馏水,校正pH为72,过滤分装,每 瓶100ml,高压灭菌备用 2.使用前每瓶加乳糖1g,加热融化琼脂,冷至50℃左右,加入1%中性红溶液0.5ml 摇匀,分装于灭菌平皿,放4℃冰箱保存备用 七)亚碲酸钾平板:用与棒状杆菌分离鉴定。 【成份】3%肉汤琼脂 100 ml 1%亚碲酸钾 2 ml 5%胱氨酸 2 ml 无菌脱纤维兔或羊血5-10ml 【方法】 1.加热融化琼脂,冷至50℃左右,无菌操作加入灭菌的肉汤、亚碲酸钾溶液和胱氨 酸溶液,并加入脱纤维兔或羊血,混匀(注意勿产生气泡),然后无菌分装于灭菌平皿中。 2.制成血液琼脂平板,放4℃冰箱保存备用。 (八)庖肉培养基:用于培养和保存厌氧菌 【成份】庖牛肉 肉汤培养基10-12ml 【方法】 1.庖牛肉制备:取去筋膜脂肪的牛肉约500g,切成豆丁,用1000m1蒸馏水,文火煮 约1小时,冷却后用纱布过滤,收集牛肉渣
12 ml, 0.4%酚红 0.6 ml, 硫代硫酸钠 0.02 g, 无水硫酸亚铁 0.02 g 下层：蛋白胨 1 g, 琼脂 6.3 g, 牛肉膏 0.3 g, 葡萄糖 0.1 g, 氯化钠 0.5 g, 蒸馏 水 100 ml, 0.4%酚红 0.6 ml 【方法】 1．除琼脂和酚红外，将上层或下层的其余各成份分别溶解于蒸馏水，校正 pH 为 7.6； 2．加入琼脂加热融化，再加入酚红溶液摇匀，分层分装试管，高压灭菌 121℃ 20 min， 放 4 ℃冰箱保存备用。 （六）麦康凯琼脂糖培养基：常用的选择培养基，用于肠道致病菌的分离与鉴定。 【成份】蛋白胨 20 g 氯化钠 5 g 胆盐 5 g 琼脂 20 g 蒸馏水 1000 ml 乳糖 10 g 1.0%中性红溶液 5 ml 【方法】 1．上述成分除乳糖、中性红和琼脂外，溶解于蒸馏水，校正 pH 为 7.2，过滤分装，每 瓶 100 ml，高压灭菌备用。 2．使用前每瓶加乳糖 1 g，加热融化琼脂，冷至 50℃左右，加入 1%中性红溶液 0.5 ml， 摇匀，分装于灭菌平皿，放 4 ℃冰箱保存备用。 （七）亚碲酸钾平板：用与棒状杆菌分离鉴定。 【成份】3%肉汤琼脂 l00 ml 1%亚碲酸钾 2 ml 5%胱氨酸 2 ml 无菌脱纤维兔或羊血 5-10 ml 【方法】 1．加热融化琼脂，冷至 50 ℃左右，无菌操作加入灭菌的肉汤、亚碲酸钾溶液和胱氨 酸溶液，并加入脱纤维兔或羊血，混匀（注意勿产生气泡），然后无菌分装于灭菌平皿中。 2．制成血液琼脂平板，放 4 ℃冰箱保存备用。 （八）庖肉培养基：用于培养和保存厌氧菌。 【成份】庖牛肉 5-10 g 肉汤培养基 l0-12 ml 【方法】 1．庖牛肉制备：取去筋膜脂肪的牛肉约 500g,切成豆丁，用 1000 ml 蒸馏水，文火煮 约 1 小时，冷却后用纱布过滤，收集牛肉渣
2.将适量牛肉渣装入普通玻璃试管中,加12m1普通肉汤培养基,用异丁基橡胶塞紧, 并插入一个针头。 3.121℃灭菌20min,立即拔出针头,并塞紧管塞。放4℃冰箱保存备用。使用前水浴煮 沸10min驱氧。 (九)罗氏培养基:用于结核分枝杆菌的培养和保种。 【成份】磷酸二氢钾(无水) 2.4g 硫酸镁(MgSO47H2O)0.24g 枸橼酸镁 0.6g 2%孔雀绿水溶液 天门冬素 3.6 中性甘油 蒸馏水 600ml 马铃薯淀粉 30g 新鲜鸡蛋液 1000ml 【方法】 将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、天冬素、甘油和蒸馏水混合于烧瓶内,在沸水 浴中加热溶解; 2.加入马铃薯淀粉,继续加热lh,时时摇动烧瓶使溶解,置于56℃水浴箱内Ih 3.将新鲜鸡蛋用水洗净后,放入75%酒精消毒30min,无菌击破蛋壳,将蛋黄蛋白 并收集于灭菌容器内,充分搅拌,无菌纱布过滤,收集新鲜鸡蛋液1000ml,加于上述混合 液中 4.加入已灭菌的2%孔雀绿水溶液20ml,均匀混合后分装于灭菌的中号试管内,每管 7-8ml,加塞后斜置血清凝固器或流动蒸汽灭菌器内,85℃Ih间歇灭菌两次,4℃冰箱保 存备用。 二、细菌接种法 细菌的接种方法因各种培养基不同而异,常用的方法有平板、斜面、液体和半固体接种。 【材料】 琼脂斜面、琼脂平板、肉汤培养基。 葡萄球菌、大肠杄菌斜面培养物。 【方法 (一)平板接种法:细菌在自然界及人体中分布广,种类多,因此在临床各种检验标本中 如粪便、痰、脓液中常混有多种细菌。欲检査病人标本中是否有某种病原菌时,须先将各种 细菌分离,获得纯菌培养物后才能进一步进行细菌的鉴定。琼脂平板培养基,因其面积大。 接种后可达到分离的目的,常称分离培养法。平板接种法有多种,以下介绍平行划线法及分
13 2．将适量牛肉渣装入普通玻璃试管中，加 12 ml 普通肉汤培养基，用异丁基橡胶塞紧， 并插入一个针头。 3. 121℃灭菌 20 min,立即拔出针头，并塞紧管塞。放 4℃冰箱保存备用。使用前水浴煮 沸 10 min 驱氧。 （九）罗氏培养基：用于结核分枝杆菌的培养和保种。 【成份】 磷酸二氢钾（无水） 2.4 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.24 g 枸橼酸镁 0.6 g 2%孔雀绿水溶液 20 ml 天门冬素 3.6 g 中性甘油 12 ml 蒸馏水 600 ml 马铃薯淀粉 30 g 新鲜鸡蛋液 1000 ml 【方法】 1．将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、天冬素、甘油和蒸馏水混合于烧瓶内，在沸水 浴中加热溶解； 2．加入马铃薯淀粉，继续加热 1 h，时时摇动烧瓶使溶解，置于 56 ℃水浴箱内 1 h； 3．将新鲜鸡蛋用水洗净后，放入 75%酒精消毒 30 min，无菌击破蛋壳，将蛋黄蛋白一 并收集于灭菌容器内，充分搅拌，无菌纱布过滤，收集新鲜鸡蛋液 1000 ml，加于上述混合 液中； 4．加入已灭菌的 2%孔雀绿水溶液 20 ml，均匀混合后分装于灭菌的中号试管内，每管 7~8 ml，加塞后斜置血清凝固器或流动蒸汽灭菌器内，85 ℃ 1 h 间歇灭菌两次，4 ℃冰箱保 存备用。 二、细菌接种法 细菌的接种方法因各种培养基不同而异，常用的方法有平板、斜面、液体和半固体接种。 【材料】 琼脂斜面、琼脂平板、肉汤培养基。 葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物。 【方法】 (一) 平板接种法：细菌在自然界及人体中分布广，种类多，因此在临床各种检验标本中， 如粪便、痰、脓液中常混有多种细菌。欲检查病人标本中是否有某种病原菌时，须先将各种 细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步进行细菌的鉴定。琼脂平板培养基，因其面积大。 接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种法有多种，以下介绍平行划线法及分
区划线法。 1.平行划线法 (1)用无菌接种环取细菌培养物少许。 (②)左手拿住琼脂平板底部,盖留在桌上(一般是将制成的琼脂平板倒放,即带有培养 基的底部在上方),使平板直立,以免空气的细菌落人培养基中,并靠近火焰处操作 (3)右手握持沾菌的接种环涂抹在琼脂平板上端,然后连续平行划线于平板的上半部。 将平板转180°,自平板另一端开始再划线于中央为止。 划线时使接种环与平板表面成15°-30°轻轻接触,以腕力在平板表面作轻快的滑动 所划线条应致密而均匀。并应到达平板的边缘,充分利用培养基的面积;同时接种环与琼脂 面间的角度不宜过大,以免划破琼脂 (4)划线完毕,盖上平板盖,接种环灭菌后放回原处 (5)于琼脂底面玻璃上贴标鉴,注明标本名称、日期、姓名、置37℃温箱,培养18-24h 2.分区划线法(图2-1):取一接种环材料,划线在平板上1/3的面积a,转动平板约70° 接种环灭菌,待冷后,从原接种处拉出2-3条线,划于另一个1/4的面积上b,再次烧灼接 种环。冷却后,转70°,照原法直到划满为止c、d区。一般当接种物中细菌不太多时(如脓 汁标本、液体培养物等)可以选用平行划线法;如接种物中细菌极多时(如固体菌种、粪便 等)则必须采用分区划线法始能得到良好结果。接种后,做好标记,37℃培养18-24h。 (二)琼脂斜面接种法(图2-2):多用于纯种细菌的增菌和保存菌种。 1.用灭菌接种环取细菌培养物少许。 2.拔出培养管棉塞或塑料塞,管口经火焰灭菌,将沾有细菌的接种环伸人管内,自下 而上在琼脂上婉蜒划线。 3.接种后,管口在火焰上灭菌,塞回棉塞,接种环灭菌。 4.在试管壁近管口处做好标记,置37℃培养18-24h (三)肉汤接种法(图2-3):用于增菌。 1.用灭菌接种环取细菌培养物少许。 2.以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中,将环上细菌轻轻研磨于接近液面的 管壁上,然后将试管稍倾斜,使肉汤碰及细菌,将细菌带入培养基中, (四)半固体接种法(穿刺接种法)(图2-4):用以观察细菌有无动力7℃培养18-24h。 3.接种后管口灭菌,塞回棉塞或塑料塞,接种环灭菌,并做好标记,置 半固体接种是用接种针,无菌操作方法同前。将取有细菌的接种针自培养基的中央刺 入,沿原穿刺线拔出,注意在刺人与拔出时不可晃动接种针 接种后做好标记,置37℃培养18-24h (五)倾注平板法(图2一5):用于饮水、牛乳、尿液、药物等标本的细菌计数。 方法是将经灭菌生理盐水适量稀释(通常作10-103。稀释)的标本1ml,置于灭菌平皿
14 区划线法。 1．平行划线法 (1) 用无菌接种环取细菌培养物少许。 (2) 左手拿住琼脂平板底部，盖留在桌上(一般是将制成的琼脂平板倒放，即带有培养 基的底部在上方)，使平板直立，以免空气的细菌落人培养基中，并靠近火焰处操作。 (3) 右手握持沾菌的接种环涂抹在琼脂平板上端，然后连续平行划线于平板的上半部。 将平板转 180o ，自平板另一端开始再划线于中央为止。 划线时使接种环与平板表面成 15o -30o 轻轻接触，以腕力在平板表面作轻快的滑动。 所划线条应致密而均匀。并应到达平板的边缘，充分利用培养基的面积；同时接种环与琼脂 面间的角度不宜过大，以免划破琼脂。 (4) 划线完毕，盖上平板盖，接种环灭菌后放回原处。 (5) 于琼脂底面玻璃上贴标鉴，注明标本名称、日期、姓名、置 37 ℃温箱，培养 18-24h。 2．分区划线法（图 2－1）：取一接种环材料，划线在平板上 1/3 的面积 a，转动平板约 70o ， 接种环灭菌，待冷后，从原接种处拉出 2-3 条线，划于另一个 1/4 的面积上 b，再次烧灼接 种环。冷却后，转 70o ，照原法直到划满为止 c、d 区。一般当接种物中细菌不太多时(如脓 汁标本、液体培养物等)可以选用平行划线法；如接种物中细菌极多时（如固体菌种、粪便 等）则必须采用分区划线法始能得到良好结果。接种后，做好标记，37℃培养 18-24 h。 (二) 琼脂斜面接种法（图 2－2）：多用于纯种细菌的增菌和保存菌种。 1．用灭菌接种环取细菌培养物少许。 2．拔出培养管棉塞或塑料塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸人管内，自下 而上在琼脂上婉蜒划线。 3．接种后，管口在火焰上灭菌，塞回棉塞，接种环灭菌。 4．在试管壁近管口处做好标记，置 37 o C 培养 18-24 h。 (三) 肉汤接种法（图 2－3）：用于增菌。 1．用灭菌接种环取细菌培养物少许。 2．以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的 管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌，将细菌带入培养基中。 3．接种后管口灭菌，塞回棉塞或塑料塞，接种环灭菌，并做好标记，置 37℃培养 18-24h。 (四) 半固体接种法(穿刺接种法)（图 2－4）：用以观察细菌有无动力。 半固体接种是用接种针，无菌操作方法同前。将取有细菌的接种针自培养基的中央刺 入，沿原穿刺线拔出，注意在刺人与拔出时不可晃动接种针。 接种后做好标记，置 37℃培养 18-24 h。 (五) 倾注平板法（图 2－5）：用于饮水、牛乳、尿液、药物等标本的细菌计数。 方法是将经灭菌生理盐水适量稀释(通常作 10-1-10-5。稀释)的标本 l ml，置于灭菌平皿
内,注入10-15m1已融化冷至55℃左右的适宜培养基混合,凝固后,将平板倒置于37℃ 中孵育。 图2-1分区划线接种法 图2-2斜面接种法 图2-3肉汤接种法 图2-4半固体穿刺接种法 图2-5倾注平板法 细菌培养性状观察 (一)琼脂平板上菌落观察 【材料】接种金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌的琼脂平板 1
15 内，注入 10-15ml 已融化冷至 55 ℃左右的适宜培养基混合，凝固后，将平板倒置于 37 ℃ 中孵育。 图 图 2－1 分区划线接种法 图 2－2 斜面接种法 图 2－3 肉汤接种法 图 2－4 半固体穿刺接种法 图 2－5 倾注平板法 三、细菌培养性状观察 (一) 琼脂平板上菌落观察： 【材料】接种金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草杆菌的琼脂平板；