udan edu . cn 论著 细菌学综合性实验在《医学微生物学》教学中的应用效 果分析 张俊琪谢幼华,王葳,刘晶,袁正宏,瞿涤 复旦大学基础医学院病原生物学系,上海200092 摘要:通过综合性实验“人体肠道杆菌的分离与鉴定”,让医学本科生接受包括传统的细菌学分离鉴定技术 和现代分子生物学16 S TRNA核苷酸序列分析技术在内的系统培训,更新了知识体系增加了学生的动手机 会,激发了学生的学习热情,培养了学生独立分析问题和解决问题的能力,为培养高素质应用型医学人才打 下基础 关键词:医学微生物学综合性实验;教学改革 Synergistic integration of comprehensive bacterial experiments in Medical Microbiology teaching ZHANG Jun-Qi, XIE You-Hua, WANG Wei, LIU Jing, YUAN Zheng-Hong, QU Di Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University Shanghai 200032. China Abstract: Through comprehensive experiment"Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces". medical students received systematic training of Medical Microbiology lab techniques including traditional methods for bacterial identification and modern 16s rRNA gene identification. These training inspired students for innovation and exploration. The reform lays a solid foundation for the cultivation of application-oriented medical talents Key words: Medical Microbiology Comprehensive experiment Education reform 《医学微生物学》作为临床医学、基础医学、法医较为零散,虽然包括细菌染色、平板划线、质粒转化 学、护理学等医学相关专业的必修基础课,为学习临与接合等基础性实验,但各实验之间相关性不强;② 床各科的感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤相关性疾病实验教学内容以验证性为主,缺乏探究性和综合性 等奠定了重要的理论基础。《医学微生物学》实验课内容:③某些实验教学内容陈旧,存在与临床脱节的 是理论知识实际应用和演练的平台,是《医学微生物现象。因此,传统的实验教学模式不利于学生分析 学》教学中的重要组成。实验课教学不仅是组织学问题、解决问题等综合能力的培养,也很难激发学生 生对理论知识的验证性体会,更是培养学生动手能的协作能力和创新能力,迫切需要新的教学理念的 力、综合理解能力及创新能力的重要途径。 注入和教学方法的改进,以提高本科生《医学微生物 传统的《医学微生物学》实验教学存在明显的不学》实验教学的效果 足,主要表现在以下几个方面2:①实验教学内容 在《医学微生物学》的理论和实验教学中,肠道 基金项目:教育部2013年度来华留学英语授课品牌课程建设项目,上海市2013年度来华留学英语授课品牌课程建设项目 通信作者:瞿涤 Corresponding author. QU Di, E-mail: dqua shmu. edu.cn
基金项目 ：教育部 2013 年度来华留学英语授课品牌课程建设项目 ，上海市 2013 年度来华留学英语授课品牌课程建设项目 通信作者 ：瞿涤 Corresponding author ．QU Di ，E‐mail ：dqu＠ shmu ．edu ．cn · 论著 · 细菌学综合性实验在枟医学微生物学枠教学中的应用效 果分析 张俊琪 ，谢幼华 ，王葳 ，刘晶 ，袁正宏 ，瞿涤 复旦大学基础医学院病原生物学系 ，上海 200032 摘 要 ：通过综合性实验“人体肠道杆菌的分离与鉴定” ，让医学本科生接受包括传统的细菌学分离鉴定技术 和现代分子生物学 16S rRNA 核苷酸序列分析技术在内的系统培训 ，更新了知识体系 ，增加了学生的动手机 会 ，激发了学生的学习热情 ，培养了学生独立分析问题和解决问题的能力 ，为培养高素质应用型医学人才打 下基础 。 关键词 ：医学微生物学 ；综合性实验 ；教学改革 Synergistic integration of comprehensive bacterial experiments in Medical Microbiology teaching ZHANG Jun‐Qi ，XIE You‐Hua ，WANG Wei ，LIU Jing ，YUAN Zheng‐Hong ，QU Di Department of Medical Microbiology and Parasitology ， School of Basic Medical Sciences ， Fudan University ， Shanghai 200032 ，China Abstract ：Through comprehensive experiment “Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces” ，medical students received systematic training of Medical Microbiology lab techniques including traditional methods for bacterial identification and modern 16S rRNA gene identification ．These training inspired students for innovation and exploration ．The reform lays a solid foundation for the cultivation of application‐oriented medical talents ． Key words ：Medical Microbiology ；Comprehensive experiment ；Education reform 枟医学微生物学枠作为临床医学 、基础医学 、法医 学 、护理学等医学相关专业的必修基础课 ，为学习临 床各科的感染性疾病 、免疫性疾病 、肿瘤相关性疾病 等奠定了重要的理论基础 。 枟医学微生物学枠实验课 是理论知识实际应用和演练的平台 ，是枟医学微生物 学枠教学中的重要组成 。 实验课教学不仅是组织学 生对理论知识的验证性体会 ，更是培养学生动手能 力 、综合理解能力及创新能力的重要途径 。 传统的枟医学微生物学枠实验教学存在明显的不 足 ，主要表现在以下几个方面［1 ，2 ］ ：① 实验教学内容 较为零散 ，虽然包括细菌染色 、平板划线 、质粒转化 与接合等基础性实验 ，但各实验之间相关性不强 ；② 实验教学内容以验证性为主 ，缺乏探究性和综合性 内容 ；③ 某些实验教学内容陈旧 ，存在与临床脱节的 现象 。 因此 ，传统的实验教学模式不利于学生分析 问题 、解决问题等综合能力的培养 ，也很难激发学生 的协作能力和创新能力 ，迫切需要新的教学理念的 注入和教学方法的改进 ，以提高本科生枟医学微生物 学枠实验教学的效果［3］ 。 在枟医学微生物学枠的理论和实验教学中 ，“肠道 微生物与感染 Journal of Microbes and Infections ，December 25 ，2015 ，10（6） ：365‐370 http ：∥ jmi ．fudan ．edu ．cn · 365 ·
微生物与感染 Journalof microbes and Infections, December25,2015,10(6)365-370 致病菌的分离与鉴定”一直是教学内容的重点和难系,让基础医学教学与临床医学实践更紧密地联系 点。但是,随着国家《病原微生物实验室生物安全管起来。同时,由于标本来自于正常人体,达到了病原 理条例》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌微生物实验室生物安全管理的要求。 (毒)种或样本运输管理规定》等相关实验室生物安 全法律法规的出台,志贺菌、伤寒沙门菌等重要肠道 材料与方法 致病菌实验均不能在教学实验室内进行,制约了《医1.1教学对象 本教研室就开始对本科生细菌学的实验教学内容进制本科生其中女同学26名,男同学10名六车 学微生物学》教学实验的开展。因此,从2006年起 复旦大学2011级和2012级临床医学专业 行改革,在以往实验教学的基础上重新设计和开12教学材料、教学安排及教学实验结果 展综合性实验教学活动——“人体肠道杆菌的分离12.1标本来源普通粪便标本12份,由学生自 与鉴定”,通过分离与鉴定正常人体肠道杆菌的过己采集提供,置甘油保存液中备用。 程,让学生系统地学习并理解传统的细菌分离纯化1.2.2材料与试剂API10s革兰阴性细菌生化 和生化鉴定方法。从2013年起,又逐步在该系统实反应鉴定条购自生物梅里埃中国有限公司,麦康凯 验中引入现代分子生物学的l6 SrrNA基因序列分和普通琼脂培养基购自上海疾病预防控制中心,细 析技术和方法,并在小班教学(每班20人左右)中加菌基因组提取试剂盒聚合酶链反应( polymerase 以实施。通过比较两种菌种鉴定方法的各自特点, chain reaction,PCR)扩增试剂盒(Taq)、TA克隆 增强了学生分析和解决问题的能力,更新了知识体试剂盒、琼脂糖凝胶等购自生工生物工程(上海) 表1肠道杄菌16 S rRNA通用扩增引物序列 Tab. 1 The universal primers for enterobacteriaceae 16s rRNA Primer Size of PCR product 16S rRNA-27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG About 1, 45 kb 16S rRNA-1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 表2实验安排 Tab 2 Arrangement of experiment 第9教学周 学习粪便标本的采集、保存和运输方法,采集普通粪便标本12份,并置于甘油保存液中保存备用 第10教学周 麦康凯平板上分区划线接种粪便标本,置37℃培养16~18h后于4℃冷库保存备用 第11教学周 观察并记录麦康凯平板上菌落的特征,从中选取单个菌落进行革兰染色,同时取该单个菌落接种于 液体培养基增菌,培养物于4℃冷库保存备用 第12教学周 (1)制备实验要求密度的待检细菌悬液并接种于API10S革兰阴性细菌生化反应鉴定条,于37℃ 培养16~18h后置4℃冷库保存1周备用 (2)K-B纸片扩散法药敏试验测定待检细菌对4种抗生素(卡那霉素、庆大霉素、链霉素和复合磺 胺)的耐药性 (3)制备待检细菌基因组并作为16 OS rrnA扩增模板,用16 S rrNA-27F和16 S TRNA-1492R引物 扩增待检细菌16 SrrNA27~142核苷酸片段。PCR反应体系为:总体积20l,含1×PCR Buffer,1mmol/LMg2、1 mmol/L dNTPs、1mo引物、50ng模板DNA及05U7ag DNA聚合酶。反应条件:94℃预变性;94℃30s、55℃30s、72℃90s30个循环;72℃延长 7min。产物经1%凝胶电泳鉴定 (4)PCR产物经纯化、TA克隆后,送铂尚生物技术(上海)有限公司进行核苷酸序列分析 第13教学周 (1)观察并记录生化反应结果,并依据试剂盒判定方法和判断标准进行鉴定 (2)生化鉴定结果与测序鉴定结果比对分析 (3)观察并记录药敏试验结果
致病菌的分离与鉴定”一直是教学内容的重点和难 点 。 但是 ，随着国家枟病原微生物实验室生物安全管 理条例枠和枟可感染人类的高致病性病原微生物菌 （毒）种或样本运输管理规定枠等相关实验室生物安 全法律法规的出台 ，志贺菌 、伤寒沙门菌等重要肠道 致病菌实验均不能在教学实验室内进行 ，制约了枟医 学微生物学枠教学实验的开展 。 因此 ，从 2006 年起 ， 本教研室就开始对本科生细菌学的实验教学内容进 行改革［4］ ，在以往实验教学的基础上重新设计和开 展综合性实验教学活动 ——— “人体肠道杆菌的分离 与鉴定” ，通过分离与鉴定正常人体肠道杆菌的过 程 ，让学生系统地学习并理解传统的细菌分离纯化 和生化鉴定方法 。 从 2013 年起 ，又逐步在该系统实 验中引入现代分子生物学的 16S rRNA 基因序列分 析技术和方法 ，并在小班教学（每班 20 人左右）中加 以实施 。 通过比较两种菌种鉴定方法的各自特点 ， 增强了学生分析和解决问题的能力 ，更新了知识体 系 ，让基础医学教学与临床医学实践更紧密地联系 起来 。 同时 ，由于标本来自于正常人体 ，达到了病原 微生物实验室生物安全管理的要求［3‐5 ］ 。 1 材料与方法 1 ．1 教学对象 复旦大学 2011 级和 2012 级临床医学专业六年 制本科生 ，其中女同学 26 名 ，男同学 10 名 。 1 ．2 教学材料 、教学安排及教学实验结果 1 ．2 ．1 标本来源 普通粪便标本 12 份 ，由学生自 己采集提供 ，置甘油保存液中备用 。 1 ．2 ．2 材料与试剂 API 10S 革兰阴性细菌生化 反应鉴定条购自生物梅里埃中国有限公司 ，麦康凯 和普通琼脂培养基购自上海疾病预防控制中心 ，细 菌基因组提取试剂盒 、聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）扩增试剂盒（ Taq） 、TA 克隆 试剂盒 、琼脂糖凝胶等购自生工生物工程（上海）有 表 1 肠道杆菌 16S rRNA 通用扩增引物序列 Tab ．1 The universal primers for enterobacteriaceae 16S rRNA Primer Sequence （5′‐3′） Size of PCR product 16S rRNA‐27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16S rRNA‐1492R GGTTACCTTGTTACGACTT About 1 ．45 kb a 表 2 实验安排 Tab ．2 Arrangement of experiment 第 9 教学周 学习粪便标本的采集 、保存和运输方法 ，采集普通粪便标本 12 份 ，并置于甘油保存液中保存备用 第 10 教学周 麦康凯平板上分区划线接种粪便标本 ，置 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h 后于 4 ℃ 冷库保存备用 第 11 教学周 观察并记录麦康凯平板上菌落的特征 ，从中选取单个菌落进行革兰染色 ，同时取该单个菌落接种于 LB 液体培养基增菌 ，培养物于 4 ℃ 冷库保存备用 第 12 教学周 （1） 制备实验要求密度的待检细菌悬液并接种于 API 10S 革兰阴性细菌生化反应鉴定条 ，于 37 ℃ 培养 16 ～ 18 h 后置 4 ℃ 冷库保存 1 周备用 （2） K‐B 纸片扩散法药敏试验测定待检细菌对 4 种抗生素（卡那霉素 、庆大霉素 、链霉素和复合磺 胺）的耐药性 （3） 制备待检细菌基因组并作为 16S rRNA 扩增模板 ，用 16S rRNA‐27F 和 16S rRNA‐1492R 引物 扩增待检细菌 16S rRNA 27 ～ 1 492核苷酸片段 。 PCR 反应体系为 ：总体积 20 μl ，含 1 × PCR Buffer 、1 mmol／L Mg 2 ＋ 、1 mmol／L dNTPs 、1 μmol／L 引物 、50 ng 模板 DNA 及0 ．5 U Taq DNA 聚合酶 。 反应条件 ：94 ℃ 预变性 ；94 ℃ 30 s 、55 ℃ 30 s 、72 ℃ 90 s ，30 个循环 ；72 ℃ 延长 7 min 。 产物经 1％ 凝胶电泳鉴定 （4） PCR 产物经纯化 、TA 克隆后 ，送铂尚生物技术（上海）有限公司进行核苷酸序列分析 第 13 教学周 （1） 观察并记录生化反应结果 ，并依据试剂盒判定方法和判断标准进行鉴定 （2） 生化鉴定结果与测序鉴定结果比对分析 （3） 观察并记录药敏试验结果 · 366 · 微生物与感染 Journal of Microbes and Infections ，December 25 ，2015 ，10（6） ：365‐370
张俊琪、等细菌学综合性实验在《医学微生物学》教学中的应用效果分析 限公司。DNA引物由生工生物工程(上海)有限公 司合成并经聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis PAGE)纯化,引物序列见表1 核苷酸序列测定由铂尚生物技术(上海)有限公司 完成。 1.23教学实验安排及方法综合性实验“人体肠 道杆菌的分离与鉴定”安排在细菌学教学活动的后 半部,分5次在5周内完成。此时,学生已具备基本 的感染性疾病微生物学检查方法的理论知识,并已 接受医学微生物学的基本操作训练。整个实验完全 在学生正常实验课时间进行,不占据学生的课外时 间。具体安排见表2 2结果 2.1学生实验结果 学生实验结果与预期相同:正常人体肠道杆菌 发酵或不发酵乳糖,在麦康凯培养基上呈现为无色^: solated colonies on MacConkey agar from human feces 或粉红色菌落,为革兰阴性杆菌(图1)。APII0S革 Gram staining 图1人体肠道杆菌菌落特征(麦康凯)和革兰染色 兰阴性细菌生化反应鉴定条、16 STRNA PCR产物 Fig 1 Isolated colonies on MacConkey agar from human feces 电泳图和药敏试验结果见图2和表3。 and gram staining ONPG GLU ARA LDC ODC CIT H2S URE TDA IND C A: API 1OS strip identification. B: Amplification of 16s rRNA (27F, 1492R).C: Antimicrobial susceptibility testing 图2API10S革兰阴性细菌生化反应鉴定条、16 SrrNA扩增和药敏试验结果 Fig 2 APl IOS strip identification, 16s rRNA POR amplification and antimicrobial susceptibility testing results 22教学效果分析 括核酸提取、PCR、DNA电泳、核酸产物纯化和TA 2.2.1学生实验操作分析整个实验涵盖了微生克隆等,个别学生最终没能得到l6 SrRNA的测序 物学实验的基本操作,学生在前几次实验课已接受结果。这也提示,在今后的实验教学中需加强学生 了诸如革兰染色、分区划线接种、液体培养基接种等微生物分子生物学理论和实际操作的训练。实验操 基本微生物学实验技能和无菌操作技能的培训,能作分析结果见表4。 比较独立、准确地完成整个系统实验。但是,由于学2.2.2综合性教学实验“人体肠道杆菌的分离与 生在前期没有接受系统的分子生物学实验培训,包鉴定”问卷调查为进一步考察本次综合性教学实
限公司 。 DNA 引物由生工生物工程（上海）有限公 司合成并经聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis ，PAGE）纯化 ，引物序列见表 1 。 核苷酸序列测定由铂尚生物技术（上海）有限公司 完成 。 1 ．2 ．3 教学实验安排及方法 综合性实验“人体肠 道杆菌的分离与鉴定”安排在细菌学教学活动的后 半部 ，分 5 次在 5 周内完成 。 此时 ，学生已具备基本 的感染性疾病微生物学检查方法的理论知识 ，并已 接受医学微生物学的基本操作训练 。 整个实验完全 在学生正常实验课时间进行 ，不占据学生的课外时 间 。 具体安排见表 2 。 2 结果 2 ．1 学生实验结果 学生实验结果与预期相同 ：正常人体肠道杆菌 发酵或不发酵乳糖 ，在麦康凯培养基上呈现为无色 或粉红色菌落 ，为革兰阴性杆菌（图 1） 。 API 10S 革 兰阴性细菌生化反应鉴定条 、16S rRNA PCR 产物 电泳图和药敏试验结果见图 2 和表 3 。 A ：Isolated colonies on MacConkey agar from human feces ． B ： Gram staining ． 图 1 人体肠道杆菌菌落特征（麦康凯）和革兰染色 Fig ．1 Isolated colonies on MacConkey agar from human feces and Gram staining A ：API 10S strip identification ．B ：Amplification of 16S rRNA （27F ，1492R） ．C ：Antimicrobial susceptibility testing ． 图 2 API 10S革兰阴性细菌生化反应鉴定条 、16S rRNA 扩增和药敏试验结果 Fig ．2 API 10S strip identification ，16S rRNA PCR amplification and antimicrobial susceptibility testing results 2 ．2 教学效果分析 2 ．2 ．1 学生实验操作分析 整个实验涵盖了微生 物学实验的基本操作 ，学生在前几次实验课已接受 了诸如革兰染色 、分区划线接种 、液体培养基接种等 基本微生物学实验技能和无菌操作技能的培训 ，能 比较独立 、准确地完成整个系统实验 。 但是 ，由于学 生在前期没有接受系统的分子生物学实验培训 ，包 括核酸提取 、PCR 、DNA 电泳 、核酸产物纯化和 TA 克隆等 ，个别学生最终没能得到 16S rRNA 的测序 结果 。 这也提示 ，在今后的实验教学中需加强学生 微生物分子生物学理论和实际操作的训练 。 实验操 作分析结果见表 4 。 2 ．2 ．2 综合性教学实验 “人体肠道杆菌的分离与 鉴定”问卷调查 为进一步考察本次综合性教学实 张俊琪 ，等 ：细菌学综合性实验在枟医学微生物学枠教学中的应用效果分析 · 367 ·
微生物与感染 Journalof microbes and Infections, December25,2015,10(6)365-370 验效果,本研究在实验课结束后针对教学对象 2012级)共36名同学进行问卷调查和统计分析,结 复旦大学临床医学专业六年制2个年级(2011级和果见表5。 表3AP10S与16 SrRNA鉴定及药敏试验结果 Tab 3 Identification and antimicrobial susceptibility testing results No. API lOS identification Antimicrobial susceptibility testing 16S rRNA identification STR GEN 1 Escherichia coli I Escherichia coli 3 Serratia odorifera or Escherichia coli l Escherichia coli 4 Escherichia coli l Escherichia coli 5 Escherichia coli I Escherichia coli R R 6 Escherichia coli l Cronobacter sakazakii 7 Serratia odorifera or Escherichia coli I Escherichia coli 8 9 Escherichia coli or Shigella spp Escherichia coli R 10 Escherichia coli 2 or Pantoea spp. 2 Escherich R 12 Escherichia coli l or Cronobacter sakazakii Cronobacter sakazakii SXT, sulfamethoxazole KAN, kanamycin STR, streptomycin: GEN, gentamycin: S, sensitive:R, resistant I, inter mediate 表4“人体肠道杆菌的分离与鉴定”综合性实验学生操作分析 Tab 4 Assessment of students'operation on comprehensive experiment"Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces Probability of No. Experimental procedure P Cause of failure success 1 Plate streaking Getting a single colony 2 Gram staining Gram negative bacilli Unsuccessful discoloration 3 Liquid culture inoculation 4 Setting, reading and Bacterial identification API 1OS strip enables the identification interpreting API lOS strip and some species are not included in the database 5 Bacterial genome preparation PCR template No products due to unskilled impro ation or careless operation of genomic DNA 6 16S rRNA amplificatio Bacterial identification 7 PCR fragment purification Bacterial identification 80.6 No products due to improper operation of DNA fragment purification TA cloning 8 16S rRNA sequence analysis Bacterial identification 9 Antimicrobial susceptibility Measurement of 100 testing inhibition
验效果 ，本研究在实验课结束后针对教学对象 ——— 复旦大学临床医学专业六年制 2 个年级（2011 级和 2012 级）共 36 名同学进行问卷调查和统计分析 ，结 果见表 5 。 表 3 API 10S与 16S rRNA 鉴定及药敏试验结果 Tab ．3 Identification and antimicrobial susceptibility testing results No ． API 10S identification 16S rRNA identification Antimicrobial susceptibility testing SXT KAN STR GEN 1 Escherichia coli 1 Escherichia coli S S S I 2 Escherichia coli 1 Escherichia coli S S I S 3 Serratia odorifera or Escherichia coli 1 Escherichia coli R I I R 照 4 Escherichia coli 1 Escherichia coli I S S S 5 Escherichia coli 1 Escherichia coli R S I R 6 Escherichia coli 1 Cronobacter sakazakii S S S I 7 Serratia odorifera or Escherichia coli 1 Escherichia coli I I I R 照 8 Escherichia coli or Shigella spp ． Escherichia coli R I I R 9 Escherichia coli or Shigella spp ． Escherichia coli R S S I 10 Escherichia coli 2 or Pantoea spp ．2 Escherichia coli S I S R y6 11 Klebsiella pneumoniae ssp ． pneumoniae Klebsiella pneumoniae R I I R 6 12 Escherichia coli 1 or Cronobacter sakazakii Cronobacter sakazakii R I I R 6 SXT ，sulfamethoxazole ；KAN ，kanamycin ；STR ，streptomycin ；GEN ，gentamycin ；S ，sensitive ；R ，resistant ；I ，intermediate ． 表 4 “人体肠道杆菌的分离与鉴定”综合性实验学生操作分析 Tab ．4 Assessment of students’ operation on comprehensive experiment “Isolation and identification of the enterobacterial strains from human feces” No ． Experimental procedure Purpose Probability of success （％ ） Cause of failure 1 Plate streaking Getting a single colony 100 Non 悙 2 Gram staining Gram negative bacilli 89 ．9 Unsuccessful discoloration K 3 Liquid culture inoculation Cell enrichment 100 Non 悙 4 Setting ，reading and interpreting API 10S strip Bacterial identification 50 API 10S strip enables the identification y of 400 species of enterobacteriaceae ， and some species are not included in the database 5 Bacterial genome preparation PCR template preparation 77 ．8 No products due to unskilled ，improper K or careless operation of genomic DNA extraction 6 16S rRNA amplification Bacterial identification 100 Non 悙 7 PCR fragment purification Bacterial identification 80 ．6 No products due to improper operation K of DNA fragment purification TA cloning Bacterial identification 100 Non 悙 8 16S rRNA sequence analysis Bacterial identification 100 Non 悙 9 Antimicrobial susceptibility testing Measurement of inhibition zone 100 Non 悙 · 368 · 微生物与感染 Journal of Microbes and Infections ，December 25 ，2015 ，10（6） ：365‐370
张俊琪、等细菌学综合性实验在《医学微生物学》教学中的应用效果分析 表5综合性教学实验改革“人体肠道杆菌的分离与鉴定”问卷调查 Tab. 5 Survey and analysis of the comprehensive experiment teaching reform Option 1 0) Option 2 0) Option 3 0) I Resource of feces sample From students (100) From others (0) 2 Basic experimental skills training for Enhanced (94. 4) Not bad (15. 6) No help(o) microbiology 3 Basic experimental skills training for Enhanced(94. 4) Not bad (15. 6) No help (0) molecular biology Applications in future work Very applicable(88.9) Applicable (ll. 1) Inapplicable (0) 5 Stimulating students' interest in Yes(91.7) A little (8 3) No(0) Medical Microbiology studies 3讨论 在实验方法上,引入目前已在微生物鉴定方面 得到广泛应用的16 SrrNA基因序列分析技术。传 在实验设计上,选择学生自己的粪便标本作为统的细菌鉴定主要是通过表型特征来鉴定,通过分 分离鉴定的目标具有以下优点:①作为人体肠离培养、染色镜检、菌落形态观察、生化反应特征、抗 道正常菌群的重要组成部分,粪便中含有相当数量原分型等一系列实验后综合分析得到结果,虽然广 和种类的肠道杆菌,采用麦康凯平板进行分离培养泛应用于病原菌检测,但存在费时费力、灵敏度低等 成功率很高,适用于教学实验。实验操作分析也证缺点。16 S rRNA序列存在于所有细菌的基因组 实,12份标本全部分离获得细菌。②粪便标本取材中,全长约15kb,大小适中,既有高度保守的序列 方便,无痛苦,易于保存。③对取自于自己的标本进也有高度特异性序列,充分体现了不同菌属、菌种之 行分离鉴定,强烈激发了学生的好奇心和学习兴趣。间的差异,成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工 在实验操作上,整个实验过程包括平板划线、肉具。随着PCR和核酸研究技术的不断发展,数据库 汤接种、分光光度法测定菌液密度、细菌基因组提的不断完善,其在快速、微量、准确分类鉴定和检测 取、PCR扩增及扩增产物分离与纯化、DNA片段测病原菌方面将发挥越来越大的作用。在本实验中 序前TA克隆、16 S TRNA核苷酸序列分析、药敏试利用16 S TRNA基因保守区的通用引物27F和 验等技术的综合运用,强化了学生对医学微生物学1492R,PCR扩增获得细菌样本中1.45kb的 和分子生物学基本操作技术的训练,帮助其系统回16 SrrNA基因片段,测序后将核苷酸序列与 顾细菌分离和鉴定的全过程,为今后独立从事相应 GenBank数据库比对分析,达到快速鉴定细菌的目 的医药卫生工作和科学研究工作奠定了扎实的的。16 SrrNA序列分析方法敏感、快速、可靠性 基础 高、重现性强,能弥补传统方法的不足0。通过 在实验材料上,继续引入临床常用的API10S“人体肠道杆菌的分离与鉴定”的系统过程,从传统 革兰阴性细菌生化反应鉴定条。API微生物生化鉴的分离纯化和生化鉴定到现代分子生物学的16S 定系统以微生物生化理论为基础,是目前全球微生 TRNA PCR扩增和核酸序列测定,让学生既学习和 物鉴定的“金标准”。它借助于微生物对各种生理条理解了传统细菌学分类鉴定方法,又对现代分子生 件、生化指标及代谢反应进行分析,将结果转化为软物学技术在细菌分类鉴定中的应用有了深刻认识, 件可识别的数据来进行聚类分析,并与已知的菌种达到举一反三、触类旁通的目的。 数据库比对,最终对未知细菌进行鉴定。目前已有 本实验特点是将单个小型实验组合成为系统性 约600种细菌可被鉴定。与传统方法相比,API鉴综合性实验,将单一的示教性实验转变为探究性和 定系统结果判断客观,准确可靠,且操作简单方便,实用性实验,实现了从侧重获取知识的教育向增强 是临床广泛采用的细菌鉴定标准。API10S革兰阴创造性教育的转变。实验更新了传统的知识体系, 性细菌生化反应鉴定条的引入切实做到了理论与实真正做到了理论联系实际、基础结合临床。同时,该 践、基础与临床的有机结合。 实验也增加了学生的动手机会,激发了其学习热情
表 5 综合性教学实验改革“人体肠道杆菌的分离与鉴定”问卷调查 Tab ．5 Survey and analysis of the comprehensive experiment teaching reform No ． Item Option 1 （％ ） Option 2 （％ ） Option 3 （％ ） 1 Resource of feces sample From students （100） From others （0） — N 2 Basic experimental skills training for N microbiology Enhanced （94 ．4） Not bad （15 ．6） No help （0） K 3 Basic experimental skills training for N molecular biology Enhanced （94 ．4） Not bad （15 ．6） No help （0） K 4 Applications in future work Very applicable （88 ．9） Applicable （11 ．1） Inapplicable （0） N蝌鞍 5 Stimulating students’ interest in N Medical Microbiology studies Yes （91 ．7） A little （8 ．3） No （0） � 3 讨论 在实验设计上 ，选择学生自己的粪便标本作为 分离鉴定的目标具有以下优点［4 ，5］ ：① 作为人体肠 道正常菌群的重要组成部分 ，粪便中含有相当数量 和种类的肠道杆菌 ，采用麦康凯平板进行分离培养 成功率很高 ，适用于教学实验 。 实验操作分析也证 实 ，12 份标本全部分离获得细菌 。 ② 粪便标本取材 方便 ，无痛苦 ，易于保存 。 ③ 对取自于自己的标本进 行分离鉴定 ，强烈激发了学生的好奇心和学习兴趣 。 在实验操作上 ，整个实验过程包括平板划线 、肉 汤接种 、分光光度法测定菌液密度 、细菌基因组提 取 、PCR 扩增及扩增产物分离与纯化 、DNA 片段测 序前 TA 克隆 、16S rRNA 核苷酸序列分析 、药敏试 验等技术的综合运用 ，强化了学生对医学微生物学 和分子生物学基本操作技术的训练 ，帮助其系统回 顾细菌分离和鉴定的全过程 ，为今后独立从事相应 的医药卫生工作和科学研究工作奠定了扎实的 基础 。 在实验材料上 ，继续引入临床常用的 API 10S 革兰阴性细菌生化反应鉴定条 。 API 微生物生化鉴 定系统以微生物生化理论为基础 ，是目前全球微生 物鉴定的“金标准” 。 它借助于微生物对各种生理条 件 、生化指标及代谢反应进行分析 ，将结果转化为软 件可识别的数据来进行聚类分析 ，并与已知的菌种 数据库比对 ，最终对未知细菌进行鉴定 。 目前已有 约 600 种细菌可被鉴定 。 与传统方法相比 ，API 鉴 定系统结果判断客观 ，准确可靠 ，且操作简单方便 ， 是临床广泛采用的细菌鉴定标准 。 API 10S 革兰阴 性细菌生化反应鉴定条的引入切实做到了理论与实 践 、基础与临床的有机结合 。 在实验方法上 ，引入目前已在微生物鉴定方面 得到广泛应用的 16S rRNA 基因序列分析技术 。 传 统的细菌鉴定主要是通过表型特征来鉴定 ，通过分 离培养 、染色镜检 、菌落形态观察 、生化反应特征 、抗 原分型等一系列实验后综合分析得到结果 ，虽然广 泛应用于病原菌检测 ，但存在费时费力 、灵敏度低等 缺点 。 16S rRNA 序列存在于所有细菌的基因组 中 ，全长约1 ．5 kb ，大小适中 ，既有高度保守的序列 也有高度特异性序列 ，充分体现了不同菌属 、菌种之 间的差异 ，成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工 具 。 随着 PCR 和核酸研究技术的不断发展 ，数据库 的不断完善 ，其在快速 、微量 、准确分类鉴定和检测 病原菌方面将发挥越来越大的作用 。 在本实验中 ， 利用 16S rRNA 基因保守区的通用引物 27F 和 1492R［6‐8 ］ ，PCR 扩增获得细菌样本中1 ．45 kb 的 16S rRNA 基因 片段 ，测 序 后 将 核 苷 酸 序 列 与 GenBank 数据库比对分析 ，达到快速鉴定细菌的目 的 。 16S rRNA 序列分析方法敏感 、快速 、可靠性 高 、重现性强 ，能弥补传统方法的不足［9 ，10］ 。 通过 “人体肠道杆菌的分离与鉴定”的系统过程 ，从传统 的分离纯化和生化鉴定到现代分子生物学的 16S rRNA PCR 扩增和核酸序列测定 ，让学生既学习和 理解了传统细菌学分类鉴定方法 ，又对现代分子生 物学技术在细菌分类鉴定中的应用有了深刻认识 ， 达到举一反三 、触类旁通的目的 。 本实验特点是将单个小型实验组合成为系统性 综合性实验 ，将单一的示教性实验转变为探究性和 实用性实验 ，实现了从侧重获取知识的教育向增强 创造性教育的转变 。 实验更新了传统的知识体系 ， 真正做到了理论联系实际 、基础结合临床 。 同时 ，该 实验也增加了学生的动手机会 ，激发了其学习热情 ， 张俊琪 ，等 ：细菌学综合性实验在枟医学微生物学枠教学中的应用效果分析 · 369 ·