出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时,直接用水轻轻冲洗(不要先倾去染料再清洗,否 则背景不清),染色时间大约10min ④镜检。自然干燥后,油镜检査。 【结果】菌体和鞭毛均染成红色 【注意事项】 (1)良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件,不宣用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料 因为老龄细菌鞭毛容易脱落 (2)染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件.不洁净的载玻片可经含适量洗衣 粉的水中煮沸约20min,取出后用清水充分洗净,沥干水后置95%酒精中处理,用时取出在 火焰上烧去酒精及可能残留的油迹 (3)细菌鞭毛极细,很易脱落,在整个操作过程中,必须仔细小心,以防鞭毛脱落.挑取菌时 尽可能不带培养基。 (4)配制合格的染色剂(尤其是B液)、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间 均是鞭毛染色成败的关键。 Leifson染色法易受菌种,菌龄和室温等因素的影响,且染色液须 经15-20次过滤,要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 3.芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体 着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状).芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色 后又难以脱色这一特点而设计的.所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的 染料外,还需要加热,以促进芽胞着色.当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗,芽胞染上的颜 色难以渗出,而菌体会脱色.然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的 颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察 【材料】 菌株:培养的枯草杆菌 试剂:5%孔雀绿水溶液,0.5%蕃红水溶液,生理盐水等。 器材:小试管,接种环,玻片等 【方法 涂片:按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 染色:加5%孔雀绿水溶液于涂片处(染料以铺满涂片为度),然后用酒精灯火焰加热玻片至染 液冒蒸汽时开始计算时间,约维持5min.加热过程中要随时添加染色液,切勿让标本干 涸.(加热时温度不能太高)。 水洗:待玻片冷却后,用水轻轻地冲洗,直至流出的水中无染色液为止 复染:用蕃红液染色5min;水洗,晾干或吸干。 镜检:先低倍,再高倍,最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。 6
6 出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时，直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再清洗，否 则背景不清 ），染色时间大约 10min。 ④镜检。自然干燥后，油镜检查。 【结果】菌体和鞭毛均染成红色。 【注意事项】 （1）良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料， 因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件. 不洁净的载玻片可经含适量洗衣 粉的水中煮沸约 20min，取出后用清水充分洗净，沥干水后置 95%酒精中处理，用时取出在 火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 （3）细菌鞭毛极细,很易脱落,在整个操作过程中,必须仔细小心,以防鞭毛脱落. 挑取菌时， 尽可能不带培养基。 （4）配制合格的染色剂（尤其是 B 液 ）、充分洗去 A 液再加 B 液、掌握好 B 液的染色时间 均是鞭毛染色成败的关键。Leifson 染色法易受菌种,菌龄和室温等因素的影响,且染色液须 经 15-20 次过滤,要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 3. 芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体 着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状).芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色 后又难以脱色这一特点而设计的.所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的 染料外,还需要加热,以促进芽胞着色.当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗,芽胞染上的颜 色难以渗出,而菌体会脱色.然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的 颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察。 【材料】 菌株：培养的枯草杆菌 试剂：5%孔雀绿水溶液,0.5%蕃红水溶液，生理盐水等。 器材：小试管,接种环,玻片等。 【方法】 涂片:按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 染色:加 5%孔雀绿水溶液于涂片处(染料以铺满涂片为度),然后用酒精灯火焰加热玻片至染 液冒蒸汽时开始计算时间,约维持 5min.加热过程中要随时添加染色液,切勿让标本干 涸.(加热时温度不能太高)。 水洗:待玻片冷却后 ,用水轻轻地冲洗,直至流出的水中无染色液为止。 复染:用蕃红液染色 5min；水洗,晾干或吸干。 镜检:先低倍,再高倍,最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态
【结果】芽胞呈绿色,菌体为红色。 4.镀银染色 【材料】 菌株:钩端螺旋体培养物 试剂 (1)固定液:冰醋酸1m1,甲醛2ml,蒸馏水100m1 (②)媒染液:鞣酸5g,石炭酸lg,蒸馏水10σm。硝酸银溶液:硝酸银5g,蒸馏水100ml (3)用前取银溶液20m1,逐滴加入100g/L氢氧化铵,至产生棕色沉淀,轻摇后溶解,微 呈乳白色 器材:玻片、接种环等 【方法】 涂片:取玻片一张,放盐水2-3环,取钩端螺旋体一环,混匀作成涂片,于空气中待自然干燥 (不可用火固定); 染色:滴加固定液于已干燥标本上经1-2分钟固定,用水冲洗:加媒染剂,加温至有蒸汽出 现,作用0.5min,水洗;加硝酸银染液微加温,染色0.5min,水洗待干,镜检。 【结果】螺旋体染成棕褐色/黑褐色 四、显微镜的使用和原理 光学显微镜的物镜有低倍、高倍和油镜3种。微生物学实验室经常使用油镜,因此油镜 的使用必须熟练掌握 (一)油镜头的识别:油镜头上一般刻有90x、100×、0il或在镜头的下缘划有一黑圈 (二)油镜使用法 1.对光:用低倍镜对光,检查染色标本时光线宜强,要抬高集光器,放大光圈。 2.观察标本 (1)滴加香柏油一小滴于染色标本片上,将标本置载物台上,移置待检部分于接物镜下 (②)将油镜头移至中央对准标本,观察者的头偏向镜筒左侧,眼睛从旁观察,并缓慢向 下转动粗调节器,使镜筒下降,直至镜头浸于镜油中,但不要碰到玻璃片。然后将眼睛移至 目镜,一面观察,一面向上徐徐转动粗调节器,至视野中看到模糊物像,再换用细调节器调 到物像清晰为止。 (3)观察标本时应两眼同时张开,左眼观察,右眼用于绘图并记录结果
7 【结果】芽胞呈绿色,菌体为红色。 4.镀银染色 【材料】 菌株：钩端螺旋体培养物 试剂： （1）固定液：冰醋酸 1ml，甲醛 2ml，蒸馏水 100ml。 （2）媒染液：鞣酸 5g，石炭酸 1g，蒸馏水 100ml。硝酸银溶液：硝酸银 5g，蒸馏水 100ml。 （3）用前取银溶液 20ml，逐滴加入 100g/L 氢氧化铵，至产生棕色沉淀，轻摇后溶解，微 呈乳白色。 器材：玻片、接种环等 【方法】 涂片：取玻片一张,放盐水 2-3 环,取钩端螺旋体一环,混匀作成涂片,于空气中待自然干燥 (不可用火固定)； 染色：滴加固定液于已干燥标本上经 1-2 分钟固定，用水冲洗；加媒染剂，加温至有蒸汽出 现，作用 0.5min ，水洗；加硝酸银染液微加温，染色 0.5min，水洗待干，镜检。 【结果】螺旋体染成棕褐色/黑褐色 四、显微镜的使用和原理 光学显微镜的物镜有低倍、高倍和油镜 3 种。微生物学实验室经常使用油镜，因此油镜 的使用必须熟练掌握。 （一）油镜头的识别：油镜头上一般刻有 90×、100×、0il 或在镜头的下缘划有一黑圈。 （二）油镜使用法 1．对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强，要抬高集光器，放大光圈。 2．观察标本 (1) 滴加香柏油一小滴于染色标本片上，将标本置载物台上，移置待检部分于接物镜下。 (2) 将油镜头移至中央对准标本，观察者的头偏向镜筒左侧，眼睛从旁观察，并缓慢向 下转动粗调节器，使镜筒下降，直至镜头浸于镜油中，但不要碰到玻璃片。然后将眼睛移至 目镜，一面观察，一面向上徐徐转动粗调节器，至视野中看到模糊物像，再换用细调节器调 到物像清晰为止。 (3) 观察标本时应两眼同时张开，左眼观察，右眼用于绘图并记录结果
B’/A 玻璃//// 图1-2油镜的原理示意图 (4)标本观察完毕,向上转动粗调节器将镜筒提起,取下标本,用擦镜纸将镜头上的油 擦净。若油已干,可用擦镜纸沾少许二甲苯擦去油迹,随即用擦镜纸擦去二甲苯。然后将接 物镜转成“八”字形,以免损坏油镜。因二甲苯能溶解粘固透镜的胶质,如其未被擦去,日 久镜片将移位或脱落。 (三)显微镜油镜的原理(图1-2,图1-3) 自标本玻璃透过的光线,因介质密度不同,部分光线折射而不能进入物镜,使射入物镜 的光线减少。当使用高倍或低倍物镜时,透镜的孔径比较大,影响不显著,但油镜透镜孔径 很小,射入物镜内的光线很少,视野不明亮,物像模糊不清。若在油镜与载物玻片之间加 滴与玻璃折光率(n=1.52)相近的香柏油(n=1.55),使通过的光线不产生或少产生折射 增加进入透镜的光线,使视亮度增加,所以能清楚地看见物像 (2) 图1-3油镜加油前后光线折射比较 五、细菌形态、结构的观察 (一)细菌的基本形态 1.球菌:葡萄球菌(呈葡萄状排列)、链球菌(呈长链状排列)、脑膜炎双球菌(呈成双排 2.杆菌:大肠杆菌(呈分散状排列)、枯草杆菌(呈长链状排列)
8 D’ C’ B’ A’ 油 空 气 玻璃 A B C D 图 1-2 油镜的原理示意图 (4) 标本观察完毕，向上转动粗调节器将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸将镜头上的油 擦净。若油已干，可用擦镜纸沾少许二甲苯擦去油迹，随即用擦镜纸擦去二甲苯。然后将接 物镜转成“八”字形，以免损坏油镜。因二甲苯能溶解粘固透镜的胶质，如其未被擦去，日 久镜片将移位或脱落。 （三）显微镜油镜的原理(图 1-2，图 1-3) 自标本玻璃透过的光线，因介质密度不同，部分光线折射而不能进入物镜，使射入物镜 的光线减少。当使用高倍或低倍物镜时，透镜的孔径比较大，影响不显著，但油镜透镜孔径 很小，射入物镜内的光线很少，视野不明亮，物像模糊不清。若在油镜与载物玻片之间加一 滴与玻璃折光率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.55），使通过的光线不产生或少产生折射， 增加进入透镜的光线，使视亮度增加，所以能清楚地看见物像。 图 1-3 油镜加油前后光线折射比较 五、细菌形态、结构的观察 (一) 细菌的基本形态： 1．球菌：葡萄球菌(呈葡萄状排列)、链球菌(呈长链状排列)、脑膜炎双球菌(呈成双排 列)。 2．杆菌：大肠杆菌（呈分散状排列）、枯草杆菌（呈长链状排列）
3.弧菌:霍乱弧菌(呈分散状排列) (二)细菌的特殊结构: 1.芽胞:观察破伤风杆菌芽胞的形态 破伤风杆菌具有芽胞,用革兰染色法染色,可见破伤风杆菌为革兰氏阳性杆菌,菌体末 端有一个圆形未着色的芽胞,使整个细菌呈鼓槌状 2.荚膜:观察肺炎双球菌荚膜的形态(墨汁推片) 具有荚膜的肺炎双球菌用墨汁美蓝染色法染色后,可见菌体呈蓝色,荚膜则由墨汁黑色 背景衬托呈不着色之透明区 3.鞭毛:观察变形杆菌之鞭毛 经特殊染色法染色后,可见变形杆菌菌体周围有纤细的鞭毛。 思考题 1.观察细菌形态学的细菌涂片,为何必须制作得簿而均匀? 2.应为革兰阳性的细菌,若染成了阴性,可有哪些原因? 3.凡在显微镜下观察,发现涂片中得细菌呈红色,能否说“该细菌是革兰阴性细菌”? 为什么? (改编:王玉燕)
9 3．弧菌：霍乱弧菌（呈分散状排列）。 (二) 细菌的特殊结构： 1．芽胞：观察破伤风杆菌芽胞的形态 破伤风杆菌具有芽胞，用革兰染色法染色，可见破伤风杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体末 端有一个圆形未着色的芽胞，使整个细菌呈鼓槌状。 2．荚膜：观察肺炎双球菌荚膜的形态(墨汁推片) 具有荚膜的肺炎双球菌用墨汁美蓝染色法染色后，可见菌体呈蓝色，荚膜则由墨汁黑色 背景衬托呈不着色之透明区。 3.鞭毛：观察变形杆菌之鞭毛 经特殊染色法染色后，可见变形杆菌菌体周围有纤细的鞭毛。 思考题 1．观察细菌形态学的细菌涂片，为何必须制作得簿而均匀？ 2．应为革兰阳性的细菌，若染成了阴性，可有哪些原因？ 3．凡在显微镜下观察，发现涂片中得细菌呈红色，能否说“该细菌是革兰阴性细菌”？ 为什么？ （改编：王玉燕）
实验二细菌的人工培养 细菌的培养检査法是很重要的微生物学实验基本技术。显微镜检査有一定的局限性,如 标本内致病微生物含量少,或杂菌数量多,就需用人工培养法加以分离、增殖,然后根据其 特性加以鉴别并进行诊断。进行药物的无菌检查、菌苗的制备或基因工程中目的基因的扩增 及基因产物一目的蛋白的表达,也需进行细菌的人工培养。 培养基的配制 培养基是培养细菌的营养物制品,一般基础培养基应含有使细菌生长和繁殖的各种营养 物,包括蛋白胨、肉浸液、氯化钠、水分等,有时加琼脂以成固态。培养基按其物理性状分 固体、半固体和液体培养基。按其用途,可分基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别 培养基及厌氧培养基等。培养基制成后除含一定的营养外,还必须有一定的酸碱度(pH 7.2-7.6),本身必须澄清及保证无菌方可使用 培养基的主要用途有:(1)繁殖及分离细菌;(2)保存菌种;(3)鉴别细菌:(4)研究 细菌生理;(5)制备菌苗、抗生素或基因工程实验的细菌培养等 (一)肉汤培养基:肉汤培养基常用瘦牛肉制成,如无牛肉可用牛肉膏代替。 【成分】 新鲜绞碎瘦牛肉500g 氯化钠5g 蛋白胨 蒸馏水1000m1 【制法】 1.称取去筋膜无油脂的瘦牛肉500g,用绞肉机绞碎加水1000m1,搅匀浸于搪瓷锅内 置冰箱过夜,除去液面上的浮油。过夜的目的是使牛肉的水溶性养料充分的渗透出来。 2.次日取出,煮沸0.5h(若不经冰箱过夜,可直接煮沸1h)。用绒布过滤,肉汤中的 液体尽量挤净。 3.用1000ml肉汁中加蛋白胨10g,氯化钠5g,搅拌加热使完全溶解,并滤出肉汁,用 蒸馏水补足至原量 4.冷至40~50℃时,用氢氧化钠校正p至7.8,煮沸10min(因肉浸液中部份碳水化 合物经加热破坏,分解产酸而影响pH,加热可使其稳定),然后补充失去水分,用脱脂棉过 滤,滤液须澄清。 5.分装于试管或三角烧瓶,塞好棉塞或塑料塞,高压蒸气66.75N(15磅121℃)20mi 灭菌。 注:如有牛肉膏制肉汤培养基,配方如下: 牛肉膏 氯化钠 蛋白胨 蒸馏水 100ml
10 实验二 细菌的人工培养 细菌的培养检查法是很重要的微生物学实验基本技术。显微镜检查有一定的局限性，如 标本内致病微生物含量少，或杂菌数量多，就需用人工培养法加以分离、增殖，然后根据其 特性加以鉴别并进行诊断。进行药物的无菌检查、菌苗的制备或基因工程中目的基因的扩增 及基因产物－目的蛋白的表达，也需进行细菌的人工培养。 一、培养基的配制 培养基是培养细菌的营养物制品，一般基础培养基应含有使细菌生长和繁殖的各种营养 物，包括蛋白胨、肉浸液、氯化钠、水分等，有时加琼脂以成固态。培养基按其物理性状分 固体、半固体和液体培养基。按其用途，可分基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别 培养基及厌氧培养基等。培养基制成后除含一定的营养外，还必须有一定的酸碱度(pH 7.2-7.6)，本身必须澄清及保证无菌方可使用。 培养基的主要用途有：(1) 繁殖及分离细菌；(2) 保存菌种；(3) 鉴别细菌；(4) 研究 细菌生理；(5) 制备菌苗、抗生素或基因工程实验的细菌培养等。 （一）肉汤培养基：肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉可用牛肉膏代替。 【成分】 新鲜绞碎瘦牛肉 500g 氯化钠 5g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 【制法】 1．称取去筋膜无油脂的瘦牛肉 500g，用绞肉机绞碎加水 1000ml，搅匀浸于搪瓷锅内， 置冰箱过夜，除去液面上的浮油。过夜的目的是使牛肉的水溶性养料充分的渗透出来。 2．次日取出，煮沸 0.5h (若不经冰箱过夜，可直接煮沸 1h)。用绒布过滤，肉汤中的 液体尽量挤净。 3．用 1000ml 肉汁中加蛋白胨 10g，氯化钠 5g，搅拌加热使完全溶解，并滤出肉汁，用 蒸馏水补足至原量。 4．冷至 40~50℃时，用氢氧化钠校正 pH 至 7.8，煮沸 10min (因肉浸液中部份碳水化 合物经加热破坏，分解产酸而影响 pH，加热可使其稳定)，然后补充失去水分，用脱脂棉过 滤，滤液须澄清。 5．分装于试管或三角烧瓶，塞好棉塞或塑料塞，高压蒸气 66.75N (15 磅 121℃)20min 灭菌。 注:如有牛肉膏制肉汤培养基，配方如下： 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 蛋白胨 1g 蒸馏水 100ml