接种乙型链球菌的血平板。 【方法】菌落是经分离培养后由单个细菌生长繁殖形成的集团。不同细菌的菌落各有特 点,观察时应选择比较分散的菌落,并注意以下几个方面: 1.大小:以直径mm表示,1mm左右为小菌落:2-3m为中等大小菌落;3mm以上 为大菌落。 2.形状:有圆形或不规则。 3.边缘:有整齐或不整齐。 4.表面:有凸起、平坦、光滑、粗糙、干燥、湿润。 5.透明度:有透明或不透明。 6.颜色:产生脂溶性色素的细菌,菌落本身有颜色;产生水溶性色素的细菌,菌落周 围的培养基呈现颜色。 7.溶血性:根据细菌对红细胞的溶解作用,有完全溶血、草绿色溶血及不溶血之分。 根据菌落的特点可分为光滑型(S型)菌落及粗糙型(R型)菌落两大类。前者为圆形表 面光滑、湿润、边缘整齐、透明,后者相反。注意观察识别金黄色葡萄球菌及枯草杆菌各为 那一种菌落。 (二)肉汤培养基中细菌生长现象的观察 肉汤在未接种细菌前是澄清的,接种细菌后如有生长,表现有三种形式 1.混浊生长:液体变混浊。 2.膜状生长:液体澄清,表面有一薄层菌膜 3.沉淀生长:液体澄清,管底有沉淀物 )半固体中生长观察 半固体可观察细菌有无运动,无运动菌沿接种线生长,培养基澄清。有运动菌,接种线 模糊不清,培养基混浊。 (四)细菌的厌氧培养观察 1.庖肉基培养法的观察:庖肉基是在普通肉汤培养基中加入少许肉渣制成,肉汤上加 少许凡士林灭菌而成。将产气荚膜杆菌接种於庖肉基中,经培养后,可见肉渣变红,不消化 并产生大量气体。 2.厌氧生物袋培养法的观察(图2-6):厌氧生物袋是一种特制的不透气的塑料袋, 袋中放有气体发生小管,催化剂小管(内放钯粒)和氧化还原指示剂小管(美蓝)。接种好的平 板放入袋中。排出袋中气体,卷叠好袋口,用弹簧夹夹紧,然后折断气体发生小管中安瓿 使发生反应.产生CO2、H等,在催化剂钯的作用下,2H2+O2(袋中剩余氧)→H2O,这更 保证了无氧环境。经0.5h再折断指示剂管中美蓝液安瓿(美蓝在无氧环境中成无色美白,在 有氧环境又可变成蓝色的美蓝),如指示剂不变蓝,表示袋内已成为无氧环境,此时即可放 37℃孵育培养
16 接种乙型链球菌的血平板。 【方法】菌落是经分离培养后由单个细菌生长繁殖形成的集团。不同细菌的菌落各有特 点，观察时应选择比较分散的菌落，并注意以下几个方面： 1．大小：以直径 mm 表示，l mm 左右为小菌落；2－3 mm 为中等大小菌落；3 mm 以上 为大菌落。 2．形状：有圆形或不规则。 3．边缘：有整齐或不整齐。 4．表面：有凸起、平坦、光滑、粗糙、干燥、湿润。 5．透明度：有透明或不透明。 6. 颜色：产生脂溶性色素的细菌，菌落本身有颜色；产生水溶性色素的细菌，菌落周 围的培养基呈现颜色。 7．溶血性：根据细菌对红细胞的溶解作用，有完全溶血、草绿色溶血及不溶血之分。 根据菌落的特点可分为光滑型(S 型) 菌落及粗糙型(R 型) 菌落两大类。前者为圆形表 面光滑、湿润、边缘整齐、透明，后者相反。注意观察识别金黄色葡萄球菌及枯草杆菌各为 那一种菌落。 (二) 肉汤培养基中细菌生长现象的观察 肉汤在未接种细菌前是澄清的，接种细菌后如有生长，表现有三种形式： 1．混浊生长：液体变混浊。 2．膜状生长：液体澄清，表面有一薄层菌膜。 3．沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物。 (三) 半固体中生长观察 半固体可观察细菌有无运动，无运动菌沿接种线生长，培养基澄清。有运动菌，接种线 模糊不清，培养基混浊。 (四) 细菌的厌氧培养观察 1．庖肉基培养法的观察：庖肉基是在普通肉汤培养基中加入少许肉渣制成，肉汤上加 少许凡士林灭菌而成。将产气荚膜杆菌接种於庖肉基中，经培养后，可见肉渣变红，不消化 并产生大量气体。 2. 厌氧生物袋培养法的观察（图 2－6）：厌氧生物袋是一种特制的不透气的塑料袋， 袋中放有气体发生小管，催化剂小管(内放钯粒)和氧化还原指示剂小管(美蓝)。接种好的平 板放入袋中。排出袋中气体，卷叠好袋口，用弹簧夹夹紧，然后折断气体发生小管中安瓿， 使发生反应．产生 CO2、H2 等，在催化剂钯的作用下，2H2+O2 (袋中剩余氧) → H2O，这更 保证了无氧环境。经 0.5 h 再折断指示剂管中美蓝液安瓿(美蓝在无氧环境中成无色美白，在 有氧环境又可变成蓝色的美蓝)，如指示剂不变蓝，表示袋内已成为无氧环境，此时即可放 37 ℃孵育培养
【附录】 厌氧产气管成分:碳酸氢钠,硼氢化钾,5%柠檬酸溶液 厌氧指示管成分:0.002%美蓝,10%碱性葡萄糖。 催化反应管成分:钯(A型 」化管 关兰括示剂安瓿 一EB d呵 气倬发生安氙 图2-6厌氧生物袋 五、细菌生长曲线的制作 (一)原理 细菌的生长曲线是细菌在液体培养基中菌体数目随培养时间发生规律性的变化,通常以 细菌数量为纵坐标,以培养时间为横坐标形成的曲线。依据其生长速率的不同,可将细菌的 生长曲线分为延滞期,对数期,稳定期和衰亡期。细菌数量通常通过稀释涂布平板计数其活 菌,也可用OD测定细菌的光密度估计菌体的总数 (二)材料 (1)菌种:大肠埃希菌( E coli) (2)培养基:普通肉汤培养基 (3) Eppendorf分光光度计及1ml比色皿 (三)实验操作过程与注意事项 (1)菌种准备:取少量保存的大肠埃希菌( E coli)接种5ml肉汤培养基中,置37℃摇 床,150~200rp(转/分钟)培养12小时。 (2)将4个500m1三角烧瓶各加100m1普通肉汤培养基,37℃预热1小时。 (3)每个烧瓶各接种活化的菌种1m1,混匀后,取1ml测定ODam (4)置37℃摇床,150-200RPM培养12-16小时 (5)每隔1小时取样1m1测定0D,至ODmn稳定后并开始下降止 (6)按下表记录oD。值,用4个样品的平均值对时间做曲线
17 【附录】 厌氧产气管成分：碳酸氢钠，硼氢化钾，5％柠檬酸溶液 厌氧指示管成分：0.002％美蓝，10％碱性葡萄糖。 催化反应管成分：钯(A 型)。 图 图 2—6 厌氧生物袋 五、细菌生长曲线的制作 （一）原理 细菌的生长曲线是细菌在液体培养基中菌体数目随培养时间发生规律性的变化，通常以 细菌数量为纵坐标，以培养时间为横坐标形成的曲线。依据其生长速率的不同，可将细菌的 生长曲线分为延滞期，对数期，稳定期和衰亡期。细菌数量通常通过稀释涂布平板计数其活 菌，也可用 OD600nm测定细菌的光密度估计菌体的总数。 （二）材料 （1）菌种：大肠埃希菌（E.coli） （2）培养基：普通肉汤培养基 （3）Eppendorf 分光光度计及 1 ml 比色皿 （三）实验操作过程与注意事项 （1）菌种准备：取少量保存的大肠埃希菌（E.coli）接种 5 ml 肉汤培养基中，置 37 ℃摇 床，150~200 rpm(转/分钟)培养 12 小时。 （2）将 4 个 500ml 三角烧瓶各加 100ml 普通肉汤培养基,37℃预热 1 小时。 （3）每个烧瓶各接种活化的菌种 1ml,混匀后，取 1ml 测定 OD600nm。 （4）置 37 ℃摇床，150~200 RPM 培养 12-16 小时。 （5）每隔 1 小时取样 1ml 测定 OD600nm，至 OD600nm稳定后并开始下降止。 （6）按下表记录 OD600nm值，用 4 个样品的平均值对时间做曲线
培养时间(h) 23 13 15 样品1 样品2 样品3 样品4 平均值 思考题 1.液体、半固体、固体(斜面或平板)培养基,在实际使用中各自有哪些最常用的用 途? 2.琼脂平板培养基上出现的菌落,如何来识别是你自己接种上去的,还是杂菌污染? (改编:叶荣)
18 培养时间（h） 0 1 2 3 4 … 13 14 15 16 OD600nm 样品 1 样品 2 样品 3 样品 4 平均值 思考题 1．液体、半固体、固体（斜面或平板）培养基，在实际使用中各自有哪些最常用的用 途？ 2．琼脂平板培养基上出现的菌落，如何来识别是你自己接种上去的，还是杂菌污染？ （改编：叶荣）
实验三细菌的生化反应 各种细菌具有不同的酶,故其新陈代谢可有不同,利用各种细菌对糖和蛋白质代谢的分 解产物的不同来鉴别细菌,是常用于鉴定细菌的方法之一。这种方法称为细菌的生化反应。 生化反应中多数是检测细菌对某一种糖或蛋白质的分解代谢产物,少数是检测酶的种类或 能否利用某一物质作为营养来源。因此,临床检验上常根据各种代谢产物的测定,借以推知 有无该种特殊酶存在,而用来协助鉴定细菌。事实上细菌的生化反应最常用于种类繁多,形 态学上无法予以鉴别的肠道菌科细菌的鉴定,通常用一组生化反应组成。目前临床上最常用 的如肠杆菌科和其它非苛养Gˉ杆菌鉴定系统(API10S),具体使用方法详见实验十一章节 肠道优势菌群分离与鉴定部分。 、糖发酵试验 不同细菌具有不同的酶,可以分解相应的糖类。糖类分解后的终末产物不同,有的产酸 (如甲酸、乙酸、乳酸等),有的细菌能进一步分解酸产生气体(氢、二氧化碳).借此可协助 鉴别细菌,尤其在肠道细菌的鉴定中经常使用。 实验室用来检査糖发酵的培养基叫单糖发酵管(图3-1),是将1%的各种糖加入无糖 的蛋白胨水培养基中,再加指示剂(本实验用酚红,碱性时为红色.酸性呈黄色)和倒置小管 1个,以观察有无酸和气体产生 实验室最常用的糖有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇与蔗糖5种.分别以红、黄、蓝、 白、黑五种颜色的纸条贴在管壁上以区别各种糖类。目前市售的各种微量发酵管,于管底标 有各种颜色。 【材料】大肠杆菌和伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 葡萄糖、乳糖发酵管 【方法】将伤寒杆菌和大肠杆菌分别接种于两种糖发酵管中,37℃培养18-24h观察 结果。 【结果】首先确定细菌是否生长,细菌生长则培养基变混浊。糖是否被分解可根据以下 结果判定 (一)培养基未变色,小倒管中无气泡,表示不产酸不产气,糖未 分解,记录结果以“一”表示 (二)培养基变黄,小倒管中无气泡,表示产酸不产气,以“+” 表示。 (三)培养基变黄,小倒管中有气泡,表示产酸又产气,以“由” 表示。 图3-1单糖发 含氮化合物分解试验
19 实验三 细菌的生化反应 各种细菌具有不同的酶，故其新陈代谢可有不同，利用各种细菌对糖和蛋白质代谢的分 解产物的不同来鉴别细菌，是常用于鉴定细菌的方法之一。这种方法称为细菌的生化反应。 生化反应中多数是检测细菌对某一种糖或蛋白质的分解代谢产物，少数是检测酶的种类或 能否利用某一物质作为营养来源。因此，临床检验上常根据各种代谢产物的测定，借以推知 有无该种特殊酶存在，而用来协助鉴定细菌。事实上细菌的生化反应最常用于种类繁多，形 态学上无法予以鉴别的肠道菌科细菌的鉴定，通常用一组生化反应组成。目前临床上最常用 的如肠杆菌科和其它非苛养 G－ 杆菌鉴定系统（API 10S），具体使用方法详见实验十一章节 肠道优势菌群分离与鉴定部分。 一、糖发酵试验 不同细菌具有不同的酶，可以分解相应的糖类。糖类分解后的终末产物不同，有的产酸 (如甲酸、乙酸、乳酸等)，有的细菌能进一步分解酸产生气体(氢、二氧化碳)．借此可协助 鉴别细菌，尤其在肠道细菌的鉴定中经常使用。 实验室用来检查糖发酵的培养基叫单糖发酵管（图 3－1），是将 1％的各种糖加入无糖 的蛋白胨水培养基中，再加指示剂(本实验用酚红，碱性时为红色．酸性呈黄色)和倒置小管 1 个，以观察有无酸和气体产生。 实验室最常用的糖有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇与蔗糖 5 种．分别以红、黄、蓝、 白、黑五种颜色的纸条贴在管壁上以区别各种糖类。目前市售的各种微量发酵管，于管底标 有各种颜色。 【材料】大肠杆菌和伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 葡萄糖、乳糖发酵管。 【方法】将伤寒杆菌和大肠杆菌分别接种于两种糖发酵管中，37 o C 培养 18-24 h 观察 结果。 【结果】首先确定细菌是否生长，细菌生长则培养基变混浊。糖是否被分解可根据以下 结果判定： (一)培养基未变色，小倒管中无气泡，表示不产酸不产气，糖未 分解，记录结果以“－”表示。 (二)培养基变黄，小倒管中无气泡，表示产酸不产气，以“+” 表示。 (三)培养基变黄，小倒管中有气泡，表示产酸又产气，以“⊕” 表示。 图 3－1 单糖发酵管 二、含氮化合物分解试验
)靛基质(吲哚)产生试验 有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸形成靛基质。靛基质无色,不能直接 察见,如加入柯氏( Kovac)试剂,则试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基质结合成红色的玫 瑰靛基质,易为肉眼识别 【材料】大肠杆菌及伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 蛋白胨水培养基 柯氏试剂 【方法】将大肠杆菌和伤寒杆菌分别接种于蛋白胨水中,37℃培养18-24h。于每管 中加入柯氏试剂数滴,使成一薄层浮于液面上。轻轻摇动试管,如表层试剂呈现红色为阳性 (+),呈黄色则为阴性(-) (二)硫化氢产生试验 有些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸,生成硫化氢。硫化氢遇铅盐(醋酸铅) 或铁盐(硫酸亚铁)则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀物。黑色沉淀物越多,表示生成的硫 化氢量亦越多。实验室常采用含有醋酸铅的培养基检测硫化氢是否产生 【材料】大肠肝菌、变形杆菌琼脂斜面培养物。 醋酸铅培养基 【方法】将大肠杆菌和变形杆菌用接种针分别接种于醋酸铅培养基中,一般穿刺于培养 基贴管壁处而不是穿刺于培养基中央。37℃培养18~24h,穿刺线呈褐色者为阳性(+),不 变色者为阴性(-)。 (三)尿素分解试验 有些细菌具有尿素分解酶,能分解尿素产生大量氨。氨遇水形成氢氧化铵,使培养基 皿上升,碱性增加。实验室采用尿素培养基,其中加酚红作指示剂检査尿素分解与否 【材料】大肠杆菌、变形杆菌琼脂斜面培养物。 尿素培养基。 【方法】将大肠杆菌、变形杆菌分别接种于尿素培养基,置37℃培养18~24h,颜色 变红为阳性(+),颜色不变则为阴性(-) 三、细菌产生的酶 细菌在合成性代谢中能产生一些酶,如血浆凝固酶、透明质酸酶、氧化酶等,通过细菌 产生的酶检测试验可以了解其致病作用。 氧化酶试验: 氧化酶试验能快速鉴定具有氧化酶的细菌菌属,如奈琵氏菌属、嗜血菌属及假单胞菌属 等。其原理为:细胞色素氧化酶为氧化磷酸化反应中的一种含有正铁血红素蛋白的呼吸酶, 细胞色素存在于细菌内,在能量代谢中能利用氧作最终电子接受体,故在严格厌氧菌中无细 胞色素存在。作氧化酶试验时,基质为1%盐酸四甲基对苯二胺( Tetramethyl-p-
20 (一)靛基质(吲哚)产生试验 有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成靛基质。靛基质无色，不能直接 察见，如加入柯氏(Kovac)试剂，则试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基质结合成红色的玫 瑰靛基质，易为肉眼识别。 【材料】大肠杆菌及伤寒杆菌琼脂斜面培养物。 蛋白胨水培养基。 柯氏试剂 【方法】将大肠杆菌和伤寒杆菌分别接种于蛋白胨水中，37 ℃培养 18-24 h。于每管 中加入柯氏试剂数滴，使成一薄层浮于液面上。轻轻摇动试管，如表层试剂呈现红色为阳性 (+)，呈黄色则为阴性(-)。 (二)硫化氢产生试验 有些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。硫化氢遇铅盐(醋酸铅) 或铁盐(硫酸亚铁)则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀物。黑色沉淀物越多，表示生成的硫 化氢量亦越多。实验室常采用含有醋酸铅的培养基检测硫化氢是否产生。 【材料】大肠肝菌、变形杆菌琼脂斜面培养物。 醋酸铅培养基。 【方法】将大肠杆菌和变形杆菌用接种针分别接种于醋酸铅培养基中，一般穿刺于培养 基贴管壁处而不是穿刺于培养基中央。37℃培养 18～24h，穿刺线呈褐色者为阳性(+)，不 变色者为阴性(-)。 (三)尿素分解试验 有些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量氨。氨遇水形成氢氧化铵，使培养基 pH 上升，碱性增加。实验室采用尿素培养基，其中加酚红作指示剂检查尿素分解与否。 【材料】 大肠杆菌、变形杆菌琼脂斜面培养物。 尿素培养基。 【方法】 将大肠杆菌、变形杆菌分别接种于尿素培养基，置 37℃培养 18～24h，颜色 变红为阳性(+)，颜色不变则为阴性(-)。 三、细菌产生的酶 细菌在合成性代谢中能产生一些酶，如血浆凝固酶、透明质酸酶、氧化酶等，通过细菌 产生的酶检测试验可以了解其致病作用。 氧化酶试验： 氧化酶试验能快速鉴定具有氧化酶的细菌菌属，如奈琵氏菌属、嗜血菌属及假单胞菌属 等。其原理为：细胞色素氧化酶为氧化磷酸化反应中的一种含有正铁血红素蛋白的呼吸酶， 细胞色素存在于细菌内，在能量代谢中能利用氧作最终电子接受体，故在严格厌氧菌中无细 胞色素存在。作氧化酶试验时，基质为 1％盐酸四甲基对苯二胺 (Tetramethyl-p-