第一部分细菌学实验方法 细菌是单细胞原核生物,体积小、半透明,且种类繁多、适应环境能力强、繁殖快、代 谢活泼,易发生变异和产生耐药性。病原性细菌能产生内、外毒素及其他侵袭力物质,引起 人和动物的感染性疾病。针对对细菌生物学特性已经建立了一系列的检测和研究方法,基本 的研究和检测方法包括细菌的染色和形态学观察、人工培养、生化反应、致病物质检测、遗 传变异硏究、动物实验、药物敏感试验、免疫应答等。细菌学检测通常包括査菌和査抗体两 个方面。通过第一部分八组实验方法的训练,学生可基本掌握临床细菌学检查的常用方法 实验一细菌的染色检查法 细菌为无色半透明,未经染色不易观察其形态和结构,需经染色,显微镜放大后才清晰 可见。对细菌进行染色和观察,首先需要将临床标本或待检的细菌培养物制备成涂片,再经 相应的染色法染色后,于光学显微镜下观察。 染色方法有单染和复染两种,前者应用一种染料使细菌着色,用以观察细菌的大小、形 态和排列;后者用2种或2种以上的染料,有助于鉴别细菌,故又称鉴别染色法。常用的单 染法有美蓝和复红染色,复染法有革兰染色法和抗酸染色法。此外,还有对细菌的芽胞、鞭 毛、荚膜、细胞壁等特殊结构的特殊染色法。 细菌涂片的制作 要进行细菌染色,首先需作涂片,细菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三个步骤。 (一)涂片 1.取清洁无油载片一张,在其中央加一滴生理盐水,注意生理盐水越少越好,因为生 理盐水加多了会徒劳的延长图片的烘干时间。 2.将接种环用火焰烧红灭菌,待冷却后自琼脂斜面上取细菌少许,混于盐水滴中,轻 轻涂抹成直径约1cm大小的均匀悬液,然后将接种环烧红灭菌。制作涂片时所取的菌量不宜 过多,以免涂抹不均使细菌聚集成团,影响结果观察。若取液体标本(如肉汤培养物、脓液、 痰液等)作涂片时,可不加生理盐水而直接取标本涂片。 如用一张玻片同时做几种细菌涂片时,可用蜡笔将玻片分为数格,做好标记再进行涂片, 以免混淆。 3.接种环的灭菌和取菌法(图1-1) 灭菌:接种环在取菌前后,其金属丝部分必须用火焰烧红灭菌。方法是右手拿接种环, 将接种环垂直或15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌,待金属丝烧红后,斜执接种环将金 属柄缓慢通过火焰灭菌。切记未经灭菌的接种环不能取菌,取菌后的接种环必须灭菌后才能
1 第一部分 细菌学实验方法 细菌是单细胞原核生物，体积小、半透明，且种类繁多、适应环境能力强、繁殖快、代 谢活泼，易发生变异和产生耐药性。病原性细菌能产生内、外毒素及其他侵袭力物质，引起 人和动物的感染性疾病。针对对细菌生物学特性已经建立了一系列的检测和研究方法，基本 的研究和检测方法包括细菌的染色和形态学观察、人工培养、生化反应、致病物质检测、遗 传变异研究、动物实验、药物敏感试验、免疫应答等。细菌学检测通常包括查菌和查抗体两 个方面。通过第一部分八组实验方法的训练，学生可基本掌握临床细菌学检查的常用方法。 实验一 细菌的染色检查法 细菌为无色半透明，未经染色不易观察其形态和结构，需经染色，显微镜放大后才清晰 可见。 对细菌进行染色和观察,首先需要将临床标本或待检的细菌培养物制备成涂片，再经 相应的染色法染色后，于光学显微镜下观察。 染色方法有单染和复染两种，前者应用一种染料使细菌着色，用以观察细菌的大小、形 态和排列；后者用 2 种或 2 种以上的染料，有助于鉴别细菌，故又称鉴别染色法。常用的单 染法有美蓝和复红染色，复染法有革兰染色法和抗酸染色法。此外，还有对细菌的芽胞、鞭 毛、荚膜、细胞壁等特殊结构的特殊染色法。 一、细菌涂片的制作 要进行细菌染色，首先需作涂片，细菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三个步骤。 （一）涂片 1．取清洁无油载片一张，在其中央加一滴生理盐水，注意生理盐水越少越好，因为生 理盐水加多了会徒劳的延长图片的烘干时间。 2．将接种环用火焰烧红灭菌，待冷却后自琼脂斜面上取细菌少许 ，混于盐水滴中，轻 轻涂抹成直径约 1cm 大小的均匀悬液，然后将接种环烧红灭菌。制作涂片时所取的菌量不宜 过多，以免涂抹不均使细菌聚集成团，影响结果观察。若取液体标本（如肉汤培养物、脓液、 痰液等）作涂片时，可不加生理盐水而直接取标本涂片。 如用一张玻片同时做几种细菌涂片时，可用蜡笔将玻片分为数格，做好标记再进行涂片， 以免混淆。 3．接种环的灭菌和取菌法（图 1-1） 灭菌：接种环在取菌前后，其金属丝部分必须用火焰烧红灭菌。方法是右手拿接种环， 将接种环垂直或 15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，待金属丝烧红后，斜执接种环将金 属柄缓慢通过火焰灭菌。切记未经灭菌的接种环不能取菌，取菌后的接种环必须灭菌后才能
放在实验台上。 取菌:用左手拇指与食指中指夹住琼脂斜面试管下端,斜面朝上,试管倾斜,用右手转 动一下管口棉塞或塑料塞,在近火焰处用右手小指与掌面夹住棉塞或塑料塞并拔出,已拔出 的棉塞或塑料塞不可放在实验台上,也不可触及任何物品。试管口用火焰灭菌后,用已灭菌 并冷却的接种环伸入培养管中,自斜面上轻轻刮取细菌,取菌后将试管口再次灭菌,塞好棉 塞或塑料塞放回原处。 (二)干燥 涂片于室温自然干燥,必要时可将标本涂抹面向上,在离火焰半尺高处微微烘干。切忌 高热 (三)固定 常用加热固定法,其目的是杀死细菌,使菌体与玻片粘附牢固,在染色时不致被染液和 水冲掉。手执玻片的一端,标本面朝上,来回通过火焰3次,注意温度不可太高,以玻片反 面触及皮肤,感觉微烫为宜。 图1—1接种环取菌、灭菌法
2 放在实验台上。 取菌：用左手拇指与食指中指夹住琼脂斜面试管下端，斜面朝上，试管倾斜，用右手转 动一下管口棉塞或塑料塞，在近火焰处用右手小指与掌面夹住棉塞或塑料塞并拔出，已拔出 的棉塞或塑料塞不可放在实验台上，也不可触及任何物品。试管口用火焰灭菌后，用已灭菌 并冷却的接种环伸入培养管中，自斜面上轻轻刮取细菌，取菌后将试管口再次灭菌，塞好棉 塞或塑料塞放回原处。 （二）干燥 涂片于室温自然干燥，必要时可将标本涂抹面向上，在离火焰半尺高处微微烘干。切忌 高热。 （三）固定 常用加热固定法，其目的是杀死细菌，使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染液和 水冲掉。手执玻片的一端，标本面朝上，来回通过火焰 3 次，注意温度不可太高，以玻片反 面触及皮肤，感觉微烫为宜。 图 1－1 接种环取菌、灭菌法
常用细菌染色法 (一)单染色—美兰染色法 【材料】 菌株:白喉棒状杆菌吕氏血清斜面培养物 试剂:碱性美兰染液、生理盐水。 器材:载玻片、接种环、等 【方法 细菌涂片制作:参照“细菌涂片的制作”。 染色:在细菌涂片上滴加碱性美兰染液1-2滴,染色1-2分钟后细流水冲洗。 吸干:用吸水纸吸干玻片上水分,自然干燥2分钟 镜检:用油镜观察染好的玻片。 【结果】白喉棒状杄菌菌体呈淡蓝色,异染颗粒呈深蓝色。 (二)复染色 1.革兰染色法 【原理】革兰氏染色的原理尚未完全阐明.目前主要有细菌等电点\化学结构及细胞膜通透性 等三种学说:(1)革兰氏阳性菌等电点在PH2^3,比阴性菌(PH4^5)为低.因此阳性菌和碱性染 料的结合力比阴性菌强.(2)革兰氏阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合而 不易脱色.(3)革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜的通透性较低.因此,染料和碘的复合物不易为 乙醇所溶出.所以阳性菌仍保持原来的紫色,而阴性菌染成的紫色可被酒精脱掉后复染成红 【材料】 菌株:葡萄球菌,大肠埃希菌18-24小时普通琼脂斜面培养物。 试剂:快速革兰染色试剂盒(结晶紫染液、碘酒、95%酒精、稀释复红),生理盐 器材:载物玻片,接种环等。 【方法】 初染:涂片上加几滴结晶紫染液,染色10秒,用细流水冲洗剩留染液,甩去片上积水 煤染:加碘液,10秒,用细流水冲洗剩留染液,并甩去片上积水 脱色:加95%酒精,频频摇动玻片数秒,斜执玻片使酒精流去,再加数滴酒精,至流下的 酒精无色为止(10-20秒),细流水冲洗,甩去积水。 复染:加稀释复红10秒,细流水冲洗,甩去积水 吸水纸吸干玻片水分,并自然干燥2分钟 镜检:于光学显微镜下油镜头镜下观察 [结果]葡萄球菌经染色后呈紫色,为革兰氏阳性菌;大肠杆菌染色后呈红色,为革兰氏 阴性菌
3 二、常用细菌染色法 （一）单染色——美兰染色法 【材料】 菌株：白喉棒状杆菌吕氏血清斜面培养物 试剂：碱性美兰染液、生理盐水。 器材：载玻片、接种环、等 【方法】 细菌涂片制作：参照“细菌涂片的制作”。 染色：在细菌涂片上滴加碱性美兰染液 1-2 滴，染色 1-2 分钟后细流水冲洗。 吸干：用吸水纸吸干玻片上水分，自然干燥 2 分钟。 镜检：用油镜观察染好的玻片。 【结果】白喉棒状杆菌菌体呈淡蓝色，异染颗粒呈深蓝色。 （二）复染色 1.革兰染色法 【原理】革兰氏染色的原理尚未完全阐明.目前主要有细菌等电点\化学结构及细胞膜通透性 等三种学说: (1)革兰氏阳性菌等电点在 PH2~3,比阴性菌(PH4~5)为低.因此阳性菌和碱性染 料的结合力比阴性菌强. (2)革兰氏阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合而 不易脱色. (3)革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜的通透性较低.因此,染料和碘的复合物不易为 乙醇所溶出. 所以阳性菌仍保持原来的紫色,而阴性菌染成的紫色可被酒精脱掉后复染成红 色。 【材料】 菌株：葡萄球菌,大肠埃希菌 18-24 小时普通琼脂斜面培养物。 试剂：快速革兰染色试剂盒（结晶紫染液、碘酒、95%酒精、稀释复红），生理盐水。 器材：载物玻片,接种环等。 【方法】 初染：涂片上加几滴结晶紫染液，染色 10 秒，用细流水冲洗剩留染液，甩去片上积水。 煤染：加碘液，10 秒，用细流水冲洗剩留染液，并甩去片上积水。 脱色：加 95%酒精，频频摇动玻片数秒，斜执玻片使酒精流去，再加数滴酒精，至流下的 酒精无色为止（10-20 秒），细流水冲洗，甩去积水。 复染：加稀释复红 10 秒，细流水冲洗，甩去积水。 吸水纸吸干玻片水分，并自然干燥 2 分钟。 镜检：于光学显微镜下油镜头镜下观察 [结果]葡萄球菌经染色后呈紫色，为革兰氏阳性菌；大肠杆菌染色后呈红色，为革兰氏 阴性菌
【注意事项】 脱色是革兰染色中的关键步骤,脱色过度,可使G+菌被误染为G-菌;脱色不够,则G 菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关,一般以涂片薄而均匀为好。 细菌的染色反应,还受多种因素如菌龄、染色时间、p等的影响,只有严格正规操作 才能得到正确结果。 【附录】 1,革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 甲液(结晶紫酒精饱和液):取14g结晶紫溶于100m195%的酒精内 乙液(1%草酸铵水溶液):草酸铵0.8g溶于80m蒸馏水中 将已配好的甲液20m1和乙液80m1混合即成结晶紫染液,置瓶中备用. (2)芦戈( Lugol)氏碘液 试剂:碘1g:碘化钾2g;蒸馏水300m 配制方法:先将碘化钾2ε溶于l0om蒸馏水中,再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏 水至300m1即成。 (3)95%酒精。 (4)石炭酸复红稀释液 碱性复红饱和溶液:碱性复红3.2克溶于95%酒精100m中。 1份碱性复红饱和液加9份5%石炭酸水溶液,先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用)。取 1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。 上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮存于棕色瓶内。 2抗酸染色法 【原理】结核杆菌对苯胺染料不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用3%盐酸酒 精处理也不易脱色,再经美兰复染,结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色,而非抗酸菌和细胞杂 质等呈蓝色。 【材料】 标本:结核病人痰液。 试剂:快速结核分枝杆菌染色试剂盒(石碳酸复红,盐酸酒精,美兰)。 器材:载玻片等。 【方法 涂片制备:取患者清晨咳出痰液,用接种环小心沾取痰液(黄脓痰及可疑部分)少 许作涂片,涂片自然干燥后,通过火焰固定,然后进行染色 染色方法
4 【注意事项】 脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度,可使 G+菌被误染为 G- 菌；脱色不够，则 G- 菌可被误染为 G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。 细菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH 等的影响，只有严格正规操作， 才能得到正确结果。 【附录】 1,革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 甲液（结晶紫酒精饱和液）：取 14g 结晶紫溶于 100ml 95%的酒精内。 乙液（1%草酸铵水溶液）：草酸铵 0.8g 溶于 80ml 蒸馏水中。 将已配好的甲液 20ml 和乙液 80ml 混合即成结晶紫染液，置瓶中备用. (2)芦戈(Lugol)氏碘液 试剂：碘 1g; 碘化钾 2g; 蒸馏水 300ml。 配制方法：先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏 水至 300ml 即成。 (3)95%酒精。 (4)石炭酸复红稀释液 碱性复红饱和溶液：碱性复红 3.2 克溶于 95%酒精 100ml 中。 1 份碱性复红饱和液加 9 份 5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用)。 取 1 份石炭酸复红染液加 9 份蒸馏水即为稀释复红染液。 上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮存于棕色瓶内。 2.抗酸染色法 【原理】结核杆菌对苯胺染料不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用 3%盐酸酒 精处理也不易脱色,再经美兰复染,结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色,而非抗酸菌和细胞杂 质等呈蓝色。 【材料】 标本：结核病人痰液。 试剂：快速结核分枝杆菌染色试剂盒（石碳酸复红，盐酸酒精，美兰）。 器材：载玻片等。 【方法】 涂片制备：取患者清晨咳出痰液，用接种环小心沾取痰液（黄脓痰及可疑部分）少 许作涂片，涂片自然干燥后，通过火焰固定，然后进行染色。 染色方法：
1)将涂片平放染色架上(或电热板上),滴加石炭酸复红液(盖满涂片处,染液量宜多) 静置5分钟,冷却后用细流水冲洗,甩去剩余水分 3)以3%盐酸酒精脱色,直至涂片几乎没有红色洗脱出为止,随即用细流水冲洗。 4)再用美蓝液复染lmin,用细流水冲洗,待自然干燥,用油镜检査。 【结果】抗酸菌染成红色,非抗酸菌染成蓝色。 (三)特殊染色法 1.细菌的荚膜染色 【原理】由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体 和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈.由于荚膜的含水量在90%以 上,故染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形. 【材料】 菌株:肺炎球菌 染色液和试剂:结晶紫、20%CuS04水溶液等 器材:载玻片、玻片搁架、擦镜纸、显微镜等 【方法】 (1)制片:提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml,小鼠死亡后解剖,取腹腔液印片. 印片自然干燥,无需加热固定 (2)染色:滴加结晶紫染液,于火焰上加温染色,使冒蒸气,勿水洗.以20%CuS04溶液冲洗染液, 勿水洗,干后镜检 【结果】菌体呈现紫色,荚膜呈淡紫色。 2细菌的鞭毛染色 【目的】 【实验原理】细菌的鞭毛极细,直径一般为10—20m,只有用电子显微镜才能观察到.但是, 如采用特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到鞭毛染色方法很多,但其基本原理相 同,即在染色前先用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 【材料】 菌株:铜绿假单细胞菌半固体培养物 试剂: Leifson染色液,生理盐水等。 器材:载玻片接种环,显微镜等。 【方法 菌液的制备及涂片:将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中。待凝固后在平板 中央点接活化了3-4代的细菌,恒温培养12-16h后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 改良的 Leifson染色法:加染色液使染料覆盖涂片。在染色过程中注意观察,当整个玻片都
5 1）将涂片平放染色架上（或电热板上），滴加石炭酸复红液（盖满涂片处，染液量宜多）， 静置 5 分钟，冷却后用细流水冲洗，甩去剩余水分。 3）以 3%盐酸酒精脱色，直至涂片几乎没有红色洗脱出为止，随即用细流水冲洗。 4）再用美蓝液复染 1min，用细流水冲洗，待自然干燥，用油镜检查。 【结果】抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。 （三）特殊染色法 1. 细菌的荚膜染色 【原理】由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体 和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈.由于荚膜的含水量在 90%以 上,故染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形. 【材料】 菌株：肺炎球菌 染色液和试剂:结晶紫、20% CuSO4水溶液等。 器材: 载玻片、玻片搁架、擦镜纸、显微镜等。 【方法】 （1）制片:提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌 0.2ml,小鼠死亡后解剖,取腹腔液印片. 印片自然干燥,无需加热固定。 (2)染色:滴加结晶紫染液,于火焰上加温染色,使冒蒸气,勿水洗.以 20%CuSO4溶液冲洗染液, 勿水洗,干后镜检。 【结果】菌体呈现紫色,荚膜呈淡紫色。 2.细菌的鞭毛染色 【目的】 【实验原理】细菌的鞭毛极细,直径一般为 10—20nm,只有用电子显微镜才能观察到.但是, 如采用特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到.鞭毛染色方法很多,但其基本原理相 同,即在染色前先用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 【材料】 菌株：铜绿假单细胞菌半固体培养物 试剂：Leifson 染色液，生理盐水等。 器材：载玻片接种环,显微镜等。 【方法】 菌液的制备及涂片:将 0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中。待凝固后在平板 中央点接活化了 3-4 代的细菌,恒温培养 12-16h 后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 改良的 Leifson 染色法：加染色液使染料覆盖涂片。在染色过程中注意观察，当整个玻片都