华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University2019,405):59-70 DO:10.7671iss.1001-411X201905065 雷建军,陈长明,陈国菊,等硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展华南农业大学学报,2019,405):59-70 LEI Jianjun, CHEN Changming, CHEN Guoju, et al. Progress in glucosinolates and its molecular mechanism of biosynthesis[J] Journal of South China Agricultural University, 2019, 40(5): 59-70 硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 雷建军口,陈长明,陈国菊',曹必好',邹丽芳',吴双花,朱张生 (1华南农业大学园艺学院/农业部华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 广东广州510642;2韶关学院英东农业科学与工程学院,广东韶关512005) 摘要:硫代葡萄糖苷(简称硫苷)是植物中一种重要的植物次生代谢物质,具有很多功能,尤其是其中的萝卜硫苷的降 解产物——萝卜硫素具有抗癌作用,因此,受到广泛重视。近年来硫苷研究取得了重要进展。本文系统地介绍了硫苷 的功能、种类、分布、运输、生物合成、降解、影响合成和积累的因素、基因工程,并展望其研究前景 关键词:硫苷:十字花科:生物合成:降解:分子机理 中图分类号:S641.3 文献标志码:A 文章编号:1001-41X(2019)05-0059-1 Progress in glucosinolates and its molecular mechanism of biosynthesis LEI Jianjun, CHEN Changming, CHEN Guoju, CAO Bihao, ZOU Lifang,, wU Shuanghua, ZHU Zhangsheng College of Horticulture, South China Agricultural University/Key laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in South China, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510642, China; 2 Henry School of Agricultural Science and Engineering, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China) Abstract: Glucosinolates(GS) are important secondary metabolites in plants. They have many functions, especially the breakdown product of glucoraphanin, sulphoraphane, has anti-cancer properties and therefore has been paid great attention. A great progress has been made in research of glucosinolates in recent years. This paper presents a review on the function, type, distribution, transportation, biosynthesis and degradation of glucosinolate factors affecting the biosynthesis and accumulation, genetic engineering, prospects and so on Key words: glucosinolates; Crucifera; biosynthesis; degradation; molecular mechanism 硫代葡萄糖苷( Glucosinolates,GS,简称硫 彭佩等对十字花科植物中硫代葡萄糖苷激发 苷)是植物中一种重要的次生代谢物质。由于它对因子研究进展进行了综述。魏大勇等用全基因组 植物和人类都有很大的影响,因此,该领域已经成关联作图和共表达网络分析鉴定了油菜种子硫苷 为生物界的一个研究热点。油菜育种专家关注的重含量的候选基因。毛舒香等综述了十字花科蔬菜 点是菜饼中的有害硫苷,蔬菜育种专家更关注对人萝卜硫素合成代谢相关基因及外源调控 类有益的抗癌硫苷,医学专家关注对肿瘤细胞有抑 上述综述从某一个领域或层面介绍了硫苷的 制作用的硫苷。每年都有大量文章报道,仅SCI收研究进展,但都不够全面。本文对硫苷的作用,分 录的论文,2015-2018年分别为334、317、310和类、分布、运输、生物合成、降解、影响硫苷含量的因 287篇 素等的最新研究进展进行全面介绍,以期为读者提 收稿日期:201905-26网络首发时间:201907-23114434 网络首发地址htp/ kns cnki net/kcms/detaill/4411.201907230839004html 作者简介:雷建军(1957—),男,教授,博士,E-mail:fileid@scau.edu.cn 基金项目:国家自然科学基金(31401874);广东省科技厅项目(2018B020202010);广州市科技创新委员会项目 (201508030021)
雷建军, 陈长明, 陈国菊, 等. 硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 [J]. 华南农业大学学报, 2019, 40(5): 59-70. LEI Jianjun, CHEN Changming, CHEN Guoju, et al. Progress in glucosinolates and its molecular mechanism of biosynthesis[J]. Journal of South China Agricultural University, 2019, 40(5): 59-70. 硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 雷建军1,2，陈长明1，陈国菊1，曹必好1，邹丽芳1，吴双花1，朱张生1 (1 华南农业大学 园艺学院/农业部华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室， 广东 广州 510642； 2 韶关学院 英东农业科学与工程学院，广东 韶关 512005) 摘要: 硫代葡萄糖苷 (简称硫苷) 是植物中一种重要的植物次生代谢物质，具有很多功能，尤其是其中的萝卜硫苷的降 解产物——萝卜硫素具有抗癌作用，因此，受到广泛重视。近年来硫苷研究取得了重要进展。本文系统地介绍了硫苷 的功能、种类、分布、运输、生物合成、降解、影响合成和积累的因素、基因工程，并展望其研究前景。 关键词: 硫苷；十字花科；生物合成；降解；分子机理 中图分类号: S641.3 文献标志码: A 文章编号: 1001-411X(2019)05-0059-12 Progress in glucosinolates and its molecular mechanism of biosynthesis LEI Jianjun1,2, CHEN Changming1 , CHEN Guoju1 , CAO Bihao1 , ZOU Lifang1 , WU Shuanghua1 , ZHU Zhangsheng1 (1 College of Horticulture, South China Agricultural University/Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in South China, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510642, China; 2 Henry School of Agricultural Science and Engineering, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China) Abstract: Glucosinolates (GS) are important secondary metabolites in plants. They have many functions, especially the breakdown product of glucoraphanin, sulphoraphane, has anti-cancer properties and therefore has been paid great attention. A great progress has been made in research of glucosinolates in recent years. This paper presents a review on the function, type, distribution, transportation, biosynthesis and degradation of glucosinolate, factors affecting the biosynthesis and accumulation, genetic engineering, prospects and so on. Key words: glucosinolates; Crucifera; biosynthesis; degradation; molecular mechanism 硫代葡萄糖苷 (Glucosinolates, GS, 简称硫 苷) 是植物中一种重要的次生代谢物质。由于它对 植物和人类都有很大的影响，因此，该领域已经成 为生物界的一个研究热点。油菜育种专家关注的重 点是菜饼中的有害硫苷，蔬菜育种专家更关注对人 类有益的抗癌硫苷，医学专家关注对肿瘤细胞有抑 制作用的硫苷。每年都有大量文章报道，仅 SCI 收 录的论文，2015－2018 年分别为 334、317、310 和 287 篇。 彭佩等[1] 对十字花科植物中硫代葡萄糖苷激发 因子研究进展进行了综述。魏大勇等[2] 用全基因组 关联作图和共表达网络分析鉴定了油菜种子硫苷 含量的候选基因。毛舒香等[3] 综述了十字花科蔬菜 萝卜硫素合成代谢相关基因及外源调控。 上述综述从某一个领域或层面介绍了硫苷的 研究进展，但都不够全面。本文对硫苷的作用，分 类、分布、运输、生物合成、降解、影响硫苷含量的因 素等的最新研究进展进行全面介绍，以期为读者提 收稿日期：2019–05–26 网络首发时间：2019–07–23 11:44:34 网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20190723.0839.004.html 作者简介：雷建军（1957—），男，教授，博士，E-mail: jjlei@scau.edu.cn 基金项目：国家自然科学基金 (31401874)；广东省科技厅项目 (2018B020202010)；广州市科技创新委员会项目 (201508030021) 华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2019, 40(5): 59-70 DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.201905065
华南农业大学学报(htp/ xuebao. scau edu. cn/ar) 第40卷 供较全面的信息,对硫苷有全方位的了解 蔬菜中,经常测到的大约为9种1。不同植物的主 1硫苷的作用 要硫苷不一样,青花菜、甘蓝、花椰菜、羽衣甘蓝、芥 菜和萝卜中含量最高的硫苷分别是萝卜硫苷、芝麻 硫苷具有很多种功能,有正向功能,也有反向菜苷、屈曲花苷、2-羟基-3-丁烯基硫苷( Progoitrin, 功能。归纳起来有如下作用。 PRO)、黑芥子硫苷酸钾和芝麻菜苷122。我们在 1.1赋予食物特殊的风味 芥蓝中发现的主要硫苷是3-丁烯基硫苷。 辛辣味主要是由挥发性的烯丙基、3-丁烯基和 4-甲基硫丁烯基异硫氰酸酯( sothiocvana,4硫苷的运输 ITC)引起的 江定等对硫苷的运输进行了综述。 Andersen 2防腐和抗菌作用 等通过对拟南芥GTR( Glucosinolate transporter 吲哚类硫苷3-吲哚甲基硫苷降解生成的吲哚-1)和 GTR2(Glucosinolate transporter2)基因的单敲 3-甲醇、吲哚-3-乙酰腈等化合物、能抑制微生物生除与双敲除进行微嫁接试验,成功证明了GTR1和 长,并对昆虫和草食动物产生威慑作用,例如甲硫GTR2转运蛋白对硫苷在拟南芥根和莲座叶之间的 丙基硫苷(脂肪族硫苷)及芸苔素硫苷(吲哚族硫双向运输起作用,而且GTRI和GTR转运蛋白主 苷)与菌核病抗性呈正相关。黑介子硫苷酸钾的要涉及到长链脂肪族硫苷在地上部和地下部的双 水解产物可以防御马铃薯胞囊线虫 向运输,并提出了拟南芥中硫苷在根部和莲座叶之 13降低某些癌症发生的危险 萝卜硫苷( Glucoraphanin,GRA)降解后产生萝间运输的模型,说明硫苷的长距离运输是通过木质 部和韧皮部实现的2。Nour-Edin等用拟南芥 卜硫素,后者可以缓解化疗引起的神经性疼痛1。 GTR和GTR2的双突变体作材料,证明这2个蛋 对肿瘤细胞有抑制作用,对前列腺癌、直肠结肠白质基因突变后,合成硫苷的器官(叶和角果壁)中 癌叫、乳腺癌、胰腺癌和膀胱癌有抑制作用。 1.4导致动物甲状腺肿大 积累了大于对照10倍的脂肪族硫苷和吲哚族硫 如果摄入过多2-羟基-3-丁烯基硫苷会导致动苷,而种子中几乎没有硫苷,但如果只是单突变,仍 物甲状腺肿大吗 有一定的运输能力。 Jiang等圓从芥蓝中分离克隆 了3个GTR基因(GRT/a、GRT/b、 GITIc,并对 2硫苷的种类 其表达和功能进行了分析和鉴定,证明 GRATia和 硫苷均含有相同的核心结构:β-D-硫代葡萄糖 GRTIc具有硫苷运输功能。 基和磺酸肟,两者通过硫苷键相连,另一部分是可5硫苷的生物合成 变的基团(R侧链,R侧链来源于8种氨基酸,根据 其氨基酸的不同来源可以将硫苷分为3大类:脂肪 硫苷合成经历了从氨基酸的延伸到醛肟的生 族硫苷(R侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮成,再经过氧化、裂解和硫酸化等作用而形成最终 氨酸和异亮氨酸)芳香族硫苷(R侧链来源于含有的硫苷。根据目前研究的结果,可以将硫苷的生物 芳香环的氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸)和吲哚族硫合成途径概括为3个阶段图1:1R侧链的延伸 苷(R侧链来源于含有吲哚环的色氨酸) (仅限于蛋氨酸和苯丙氨酸来源的氨基酸):2)核心 迄今为止,已发现约200种硫苷,分布于双子结构的合成:3)侧链的修饰 叶被子植物的16个科中,其中在十字花科、白花菜51R侧链的延伸 科和番木瓜科中含量较高,尤其是十字花科中的芸 氨基酸在进入核心结构合成途径之前,蛋氨酸 苔属植物,已有学者详尽总结了硫苷的分类与结和苯丙氨酸来源的氨基酸可以经过侧链的延伸途 构μ。芸薹属植物常测到的硫苷主要有9种,但径延长氨基酸的侧链。这个过程起始于一个支链氨 Hwang等用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨基酸转氨酶( Branched- chain aminotransferase, 道阱高分辨质谱分析法,从7种十字花科蔬菜中检BCAT)的脱氨基作用,生成相应的含氧酸,然后再 测到15种硫苷 进入一个由3个连续的酶并依次交替的循环中:由 3硫苷的分布 苹果酸合成酶( Malate synthases,MAMs)催化的缩 合反应、异丙基苹果酸异构酶( Isopropylmalate 硫苷主要分布在十字花科白菜花科凹番木 Isomerases, IPMIs)催化的异构化反应和由异丙基苹 瓜种子凹中。十字花科作物中有约20种。甘蓝类果酸脱氢酶( Isopropylmalate dehydrogenase,IPM
供较全面的信息，对硫苷有全方位的了解。 1 硫苷的作用 硫苷具有很多种功能，有正向功能，也有反向 功能。归纳起来有如下作用。 1.1 赋予食物特殊的风味 辛辣味主要是由挥发性的烯丙基、3−丁烯基和 4−甲基硫−3−丁烯基异硫氰酸酯 (Isothiocyanate， ITC) 引起的[4-5]。 1.2 防腐和抗菌作用 吲哚类硫苷 3−吲哚甲基硫苷降解生成的吲哚− 3−甲醇、吲哚−3−乙酰腈等化合物, 能抑制微生物生 长，并对昆虫和草食动物产生威慑作用，例如甲硫 丙基硫苷 (脂肪族硫苷) 及芸苔素硫苷 (吲哚族硫 苷) 与菌核病抗性呈正相关[6]。黑介子硫苷酸钾的 水解产物可以防御马铃薯胞囊线虫[7] 1.3 降低某些癌症发生的危险 萝卜硫苷 (Glucoraphanin，GRA) 降解后产生萝 卜硫素，后者可以缓解化疗引起的神经性疼痛[8]。 对肿瘤细胞有抑制作用[9] ，对前列腺癌[10] 、直肠结肠 癌[11] 、乳腺癌[12] 、胰腺癌[13] 和膀胱癌[14] 有抑制作用。 1.4 导致动物甲状腺肿大 如果摄入过多 2−羟基−3−丁烯基硫苷会导致动 物甲状腺肿大[15]。 2 硫苷的种类 硫苷均含有相同的核心结构：β−D−硫代葡萄糖 基和磺酸肟，两者通过硫苷键相连，另一部分是可 变的基团 (R 侧链)，R 侧链来源于 8 种氨基酸，根据 其氨基酸的不同来源可以将硫苷分为 3 大类：脂肪 族硫苷 (R 侧链来源于蛋氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮 氨酸和异亮氨酸)、芳香族硫苷 (R 侧链来源于含有 芳香环的氨基酸、酪氨酸和苯丙氨酸) 和吲哚族硫 苷 (R 侧链来源于含有吲哚环的色氨酸)。 迄今为止，已发现约 200 种硫苷，分布于双子 叶被子植物的 16 个科中, 其中在十字花科、白花菜 科和番木瓜科中含量较高, 尤其是十字花科中的芸 苔属植物，已有学者详尽总结了硫苷的分类与结 构[16-18]。芸薹属植物常测到的硫苷主要有 9 种，但 Hwang 等[19] 用超高效液相色谱−四极杆/静电场轨 道阱高分辨质谱分析法，从 7 种十字花科蔬菜中检 测到 15 种硫苷。 3 硫苷的分布 硫苷主要分布在十字花科[20] 、白菜花科[21] 、番木 瓜种子[22] 中。十字花科作物中有约 20 种。甘蓝类 蔬菜中，经常测到的大约为 9 种[23]。不同植物的主 要硫苷不一样，青花菜、甘蓝、花椰菜、羽衣甘蓝、芥 菜和萝卜中含量最高的硫苷分别是萝卜硫苷、芝麻 菜苷、屈曲花苷、2−羟基−3−丁烯基硫苷 (Progoitrin， PRO)、黑芥子硫苷酸钾和芝麻菜苷[19, 24-25]。我们在 芥蓝中发现的主要硫苷是 3−丁烯基硫苷[23]。 4 硫苷的运输 江定等[26] 对硫苷的运输进行了综述。Andersen 等[27] 通过对拟南芥 GTR1 (Glucosinolate transporter 1) 和 GTR2(Glucosinolate transporter 2) 基因的单敲 除与双敲除进行微嫁接试验, 成功证明了 GTR1 和 GTR2 转运蛋白对硫苷在拟南芥根和莲座叶之间的 双向运输起作用, 而且 GTR1 和 GTR2 转运蛋白主 要涉及到长链脂肪族硫苷在地上部和地下部的双 向运输, 并提出了拟南芥中硫苷在根部和莲座叶之 间运输的模型，说明硫苷的长距离运输是通过木质 部和韧皮部实现的[28]。Nour-Eldin 等[29] 用拟南芥 GTR1 和 GTR2 的双突变体作材料，证明这 2 个蛋 白质基因突变后，合成硫苷的器官 (叶和角果壁) 中 积累了大于对照 10 倍的脂肪族硫苷和吲哚族硫 苷，而种子中几乎没有硫苷，但如果只是单突变，仍 有一定的运输能力。Jiang等[30] 从芥蓝中分离克隆 了 3 个 GTR 基因 (GRT1a、GRT1b、GRT1c)，并对 其表达和功能进行了分析和鉴定，证明 GRT1a 和 GRT1c 具有硫苷运输功能。 5 硫苷的生物合成 硫苷合成经历了从氨基酸的延伸到醛肟的生 成，再经过氧化、裂解和硫酸化等作用而形成最终 的硫苷。根据目前研究的结果，可以将硫苷的生物 合成途径概括为 3 个阶段[31] (图 1)：1)R 侧链的延伸 (仅限于蛋氨酸和苯丙氨酸来源的氨基酸)；2) 核心 结构的合成；3) 侧链的修饰。 5.1 R 侧链的延伸 氨基酸在进入核心结构合成途径之前，蛋氨酸 和苯丙氨酸来源的氨基酸可以经过侧链的延伸途 径延长氨基酸的侧链。这个过程起始于一个支链氨 基酸转氨酶 (Branched-chain aminotransferase， BCAT) 的脱氨基作用，生成相应的含氧酸，然后再 进入一个由 3 个连续的酶并依次交替的循环中：由 苹果酸合成酶 (Malate synthases，MAMs) 催化的缩 合反应、异丙基苹果酸异构酶 (Isopropylmalate isomerases, IPMIs) 催化的异构化反应和由异丙基苹 果酸脱氢酶 (Isopropylmalate dehydrogenase,IPM- 60 华南农业大学学报 (http://xuebao.scau.edu.cn/zr) 第 40 卷
第5期 雷建军,等:硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 61 氨基酸侧链延长 甲硫氨酸 BCAT MAMI. MAM2 MAM-L IPM. IPMDH 延长的甲硫氨酸 CYP79F1. CYP79F 脂肪族乙醛肟 CYP83AI 异硝基化合物 GSTF? S-烷基硫代氧肟 硫苷核心结构的形成 GGP1 SURI UTG74B1. UTG74CI 脱硫硫苷 ST5B STSC 硫苷核心结构 3-甲基硫代丙基硫苷 4-甲基丁基硫苷 甲基硫代戊基硫苷 或芝麻菜苷 GSL-OX V GSL-Ox iSL-OX 3-甲基亚磺酰丙基硫苷 4-甲基亚磺酰基丁基硫苷 5-甲基亚磺酰基戊基硫苷 侧链修饰 GSL-OHP 或屈曲花苷 或萝卜硫苷 或葡萄糖庭荠素 GsL·ALK GSL-OHP GSL-ALK GSL-ALK 3-羟基丙基硫苷 或黑芥子硫苷酸钾 4-羟基丁基硫苷3-丁烯基硫苷 GSL-OH 或葡萄糖异硫氰酸戊--烯酯 2-羟基一3-丁烯基硫苷 2-羟基-4-戊烯基硫苷 方向线旁边的为催化合成的酶,方向线所指的为产物:3C、4C和5C分别指含3、4和5个碳原子 The compound beside the direction line is catalytic enzyme, and the compound that the direction line points to is the reaction product; 3C, 4C and 5C represent compounds with 3, 4 and 5 carbon atoms respectively 图1脂肪族硫苷合成路径(根据 Augustine等修改) Fig. 1 General scheme for aliphatic glucosinolate biosynthesis(Modified based on Augustine et al DH催化的氧化脱羧作用。经过这一循环,氨基酸5.3侧链的修饰 的侧链会增加一个碳原子基团(—CH2一),随后延 硫苷的多样性就体现在侧链的修饰上。对于脂 伸了的氨基酸可以随即再进行下一轮的循环,从而肪族硫苷来说,R侧链的修饰主要包括氧化、羟基 继续延长侧链或者直接进入后面的核心结构的合化、烯基化和苯甲酰化等,而对于吲哚族硫苷来说, 成途径 侧链修饰主要包括羟基化和甲氧基化 52核心结构的合成 十字花科植物中的硫苷,迄今为止只测到脂肪 核心结构的合成是指将侧链延伸后的氨基酸族硫苷和吲哚族硫苷,芳香族硫苷尚未检测到。脂 经过一系列酶的催化而合成硫苷的核心结构。这一肪族硫苷和吲哚族硫苷合成路径见图1和图2 过程主要包括5个步骤13个酶。 Zhang等发现大白菜硫苷含量很低的原因 首先,由细胞色素P450的CYP79酶家族催化是MAM-3的第1个外显子中插入了1个17kb的 将侧链延伸所形成的氨基酸转变为乙醛肟,然后乙转座子,导致该基因失活 醛肟由细胞色素P450的CYP83酶家族催化形成 硫苷合成相关基因在营养器官中具有较高的 氧化腈或硝基化合物。最后,无硫硫苷在磺基转移表达量,在生殖器官中的表达量则较低,其中脂肪 酶的作用下与硫的供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸族硫苷合成相关基因在茎、叶等地上营养组织中的 (3'- phosphoadenosine-5- phosphosulfate,PAPS)反表达量较高,而吲哚族硫苷合成相关基因则在根、 应,最终在N末端生成一个SO2,从而形成了基本茎、叶等地下和地上组织中均有较高的表达,且基 的硫苷结构。 因在同一组织的不同发育时期的表达量通常具有
DH) 催化的氧化脱羧作用。经过这一循环，氨基酸 的侧链会增加一个碳原子基团 (—CH2—)，随后延 伸了的氨基酸可以随即再进行下一轮的循环，从而 继续延长侧链或者直接进入后面的核心结构的合 成途径。 5.2 核心结构的合成 核心结构的合成是指将侧链延伸后的氨基酸 经过一系列酶的催化而合成硫苷的核心结构。这一 过程主要包括 5 个步骤 13 个酶[32]。 SO−2 4 首先，由细胞色素 P450 的 CYP79 酶家族催化 将侧链延伸所形成的氨基酸转变为乙醛肟，然后乙 醛肟由细胞色素 P450 的 CYP83 酶家族催化形成 氧化腈或硝基化合物。最后，无硫硫苷在磺基转移 酶的作用下与硫的供体 3′−磷酸腺苷−5′−磷酰硫酸 (3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate, PAPS) 反 应，最终在 N 末端生成一个 ，从而形成了基本 的硫苷结构。 5.3 侧链的修饰 硫苷的多样性就体现在侧链的修饰上。对于脂 肪族硫苷来说，R 侧链的修饰主要包括氧化、羟基 化、烯基化和苯甲酰化等，而对于吲哚族硫苷来说， 侧链修饰主要包括羟基化和甲氧基化。 十字花科植物中的硫苷，迄今为止只测到脂肪 族硫苷和吲哚族硫苷，芳香族硫苷尚未检测到。脂 肪族硫苷和吲哚族硫苷合成路径见图 1 和图 2。 Zhang 等[33] 发现大白菜硫苷含量很低的原因 是 MAM-3 的第 1 个外显子中插入了 1 个 1.7 kb 的 转座子，导致该基因失活。 硫苷合成相关基因在营养器官中具有较高的 表达量，在生殖器官中的表达量则较低，其中脂肪 族硫苷合成相关基因在茎、叶等地上营养组织中的 表达量较高，而吲哚族硫苷合成相关基因则在根、 茎、叶等地下和地上组织中均有较高的表达，且基 因在同一组织的不同发育时期的表达量通常具有 甲硫氨酸 延长的甲硫氨酸 BCAT, MAM1, MAM2, MAM-L, IPM, IPMDH CYP79F1, CYP79F2 脂肪族乙醛肟 CYP83A1 异硝基化合物 S−烷基硫代氧肟 GSTF? GGP1, SUR1 S−硫代氧肟 UTG74B1, UTG74C1 脱硫硫苷 ST5B, ST5C 硫苷核心结构 3−甲基硫代丙基硫苷 4−甲基丁基硫苷 或芝麻菜苷 5−甲基硫代戊基硫苷 3−甲基亚磺酰丙基硫苷 或屈曲花苷 4−甲基亚磺酰基丁基硫苷 或萝卜硫苷 5−甲基亚磺酰基戊基硫苷 或葡萄糖庭荠素 3−羟基丙基硫苷 4−羟基丁基硫苷 3−丁烯基硫苷 2−羟基−4−戊烯基硫苷 3C 4C 5C GSL-OX GSL-OX 4−戊烯基硫苷 或葡萄糖异硫氰酸戊−4−烯酯 2−丙烯基硫苷 或黑芥子硫苷酸钾 GSL-OHP GSL-ALK GSL-OHP GSL-ALK GSL-ALK GSL-OH GSL-OH 氨基酸侧链延长 硫苷核心结构的形成 2−羟基−3−丁烯基硫苷 GSL-OX 侧链修饰 方向线旁边的为催化合成的酶，方向线所指的为产物；3C、4C 和 5C 分别指含 3、4 和 5 个碳原子 The compound beside the direction line is catalytic enzyme, and the compound that the direction line points to is the reaction product; 3C, 4C and 5C represent compounds with 3, 4 and 5 carbon atoms respectively 图 1 脂肪族硫苷合成路径 (根据 Augustine 等[31] 修改) Fig. 1 General scheme for aliphatic glucosinolate biosynthesis (Modified based on Augustine et al[31] ) 第 5 期 雷建军，等：硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 61
华南农业大学学报(http://xuebao.scau.edu.cn/zr) 第40卷 色氨酸 MYB34. MYB51. MYB122 bHLH Dof STSa 吲哚-3-甲基硫苷或芸薹硫苷 CYP8IF4 CYP8IFL. CYP81F2. CYP81F3 1-羟基吲哚-3-亚甲基硫苷 4-羟基吲哚-3-亚甲基硫苷 IGMTLIGMT2 新芸薹硫苷 甲氧基芸薹硫苷 方向线旁边的为催化合成的酶,方向线所指的为产物 The compound beside the direction line is catalytic enzyme, and the compound that the direction line points to is the reaction product 图2吲哚族硫苷合成路径 Fig. 2 General scheme for indolic glucosinolate biosynthesis 差异,表明基因的表达还具有时空特异性国 氰酸盐( Thiocyanates,TCs)和吲哚乙腈,而酶降解 MYB34和MYB51在调节吲哚族硫苷合成中只产生少量的吲哚乙腈,但生成较多TCs和甲醇 起作用3,MYB28、MYB29和MYB76在脂肪族在纯水的模拟体系中,加热合成的吲哚-3-甲基硫 硫苷合成中起重要作用 苷生成一种新的降解产物:2-(3′-吲哚甲基)硫苷, 6硫苷的降解 但这种化合物在烹饪蔬菜中还未被发现。 硫苷是水溶性物质,用传统的烹饪方法烹饪 61酶降解 后,会流失到菜汤中或因高温而降解2,但高温 在完整的植物体内,萝卜硫苷和黑芥子酶分布降解后会形成更具生物活性的异硫氰酸盐。 Runga 在不同位置上,黑芥子酶不会对硫苷产生作用, pamestry等报道甘蓝加热烹饪的初期(微波烹饪 旦组织被破坏(如被人咀嚼)就会发生作用,使硫苷2min,蒸烹7min)萝卜硫素增加,随后快速降低。 发生降解鬥。 Brandt等报道,黑暗时间延长会加 Tabart等用青花菜和红甘蓝作材料,发现传统的 速硫苷的降解。萝卜硫苷的降解产物有4种,其中水煮法,损失很大,蒸烹法损失少,微波烹饪法 最主要的是萝卜硫素和萝卜硫腈,萝卜硫素更具有1min后,青花菜和红甘蓝的萝卜硫素的含量分别 生物活性。 Liang等报道,在青花菜幼苗中,添加增加了4倍和6倍,3min后减少到烹饪前的水平, 不同的十字花科作物的汁液,对萝卜硫苷降解成萝5min后,青花菜的萝卜硫素减少到测不出来,红甘 卜硫素与萝卜硫腈的比例有很大的影响,当加入萝蓝的萝卜硫素到10min仍然维持在烹饪前的水平。 卜、芝麻菜(云芥)和小白菜汁液时,萝卜硫素比对 Okunade等报道,青花菜用低温真空法烹饪, 照(不加任何汁液)增加1.95~2.32倍,但加入芥菜在100℃下烹饪20min,原料的萝卜硫素的质量摩 汁液时,与对照没有明显差异,萝卜硫腈则相反,与尔浓度为2.05μmol·g(以干质量计),烹饪后为 萝卜硫腈形成一种消长关系 1.06μmolg(以干质量计),如果在烹饪时加入1g 62热降解 芥末萝卜硫素会增加到8.58μmolg(以干质量计) MacLeod等发现进样量及柱温都会导致硫63化学降解 苷的降解,当柱温为200℃时,烯丙基硫苷降解生 硫苷易被水解,因此介质的pH对于硫苷的稳 成44%的腈化物,32%的ITCs,同时苯甲基硫苷降定性就具有重要的意义,过酸过碱都有助于硫苷的 解生成63%的腈化物和13%的ITCs 降解。 硫苷对热的敏感性因种类而异,生成的产物也6.4微生物降解 有所差别。吲哚族硫苷比脂肪族硫苷更敏感。 Palop等通过测定42种乳酸菌对烯丙基硫 硫苷热降解的产物与酶促反应的产物不完全苷的分解,筛选岀3种能降解该硫苷的菌株,其中 相同。例如,吲哚族硫苷热处理后主要降解生成硫保加利亚乳酸杆菌 Lactobacillus agilis分解能力最强
差异，表明基因的表达还具有时空特异性[34]。 MYB34 和 MYB51 在调节吲哚族硫苷合成中 起作用[35-38] ，MYB28、MYB29 和 MYB76 在脂肪族 硫苷合成中起重要作用[38-42]。 6 硫苷的降解 6.1 酶降解 在完整的植物体内，萝卜硫苷和黑芥子酶分布 在不同位置上，黑芥子酶不会对硫苷产生作用，一 旦组织被破坏 (如被人咀嚼) 就会发生作用，使硫苷 发生降解[43]。Brandt 等[44] 报道，黑暗时间延长会加 速硫苷的降解。萝卜硫苷的降解产物有 4 种，其中 最主要的是萝卜硫素和萝卜硫腈，萝卜硫素更具有 生物活性。Liang 等[45] 报道，在青花菜幼苗中，添加 不同的十字花科作物的汁液，对萝卜硫苷降解成萝 卜硫素与萝卜硫腈的比例有很大的影响，当加入萝 卜、芝麻菜 (云芥) 和小白菜汁液时，萝卜硫素比对 照 (不加任何汁液) 增加 1.95~2.32 倍，但加入芥菜 汁液时，与对照没有明显差异，萝卜硫腈则相反，与 萝卜硫腈形成一种消长关系。 6.2 热降解 MacLeod 等[46] 发现进样量及柱温都会导致硫 苷的降解，当柱温为 200 ℃ 时, 烯丙基硫苷降解生 成 44% 的腈化物，32% 的 ITCs，同时苯甲基硫苷降 解生成 63% 的腈化物和 13% 的 ITCs。 硫苷对热的敏感性因种类而异，生成的产物也 有所差别。吲哚族硫苷比脂肪族硫苷更敏感[47]。 硫苷热降解的产物与酶促反应的产物不完全 相同。例如，吲哚族硫苷热处理后主要降解生成硫 氰酸盐 (Thiocyanates, TCs) 和吲哚乙腈，而酶降解 只产生少量的吲哚乙腈，但生成较多 TCs 和甲醇。 在纯水的模拟体系中，加热合成的吲哚−3−甲基硫 苷生成一种新的降解产物：2−(3′−吲哚甲基) 硫苷， 但这种化合物在烹饪蔬菜中还未被发现[48]。 硫苷是水溶性物质，用传统的烹饪方法烹饪 后，会流失到菜汤中[49] 或因高温而降解[25] ，但高温 降解后会形成更具生物活性的异硫氰酸盐。Rungapamestry 等[50] 报道甘蓝加热烹饪的初期 (微波烹饪 2 min，蒸烹 7 min) 萝卜硫素增加，随后快速降低。 Tabart 等[51] 用青花菜和红甘蓝作材料，发现传统的 水煮法，损失很大，蒸烹法损失少，微波烹饪法， 1 min 后，青花菜和红甘蓝的萝卜硫素的含量分别 增加了 4 倍和 6 倍，3 min 后减少到烹饪前的水平， 5 min 后，青花菜的萝卜硫素减少到测不出来，红甘 蓝的萝卜硫素到 10 min 仍然维持在烹饪前的水平。 Okunade 等[52] 报道，青花菜用低温真空法烹饪， 在 100 ℃ 下烹饪 20 min，原料的萝卜硫素的质量摩 尔浓度为 2.05 μmol ·g− 1(以干质量计)，烹饪后为 1.06 μmol ·g−1(以干质量计)，如果在烹饪时加入 1 g 芥末，萝卜硫素会增加到 8.58 μmol ·g−1(以干质量计)。 6.3 化学降解 硫苷易被水解，因此介质的 pH 对于硫苷的稳 定性就具有重要的意义，过酸过碱都有助于硫苷的 降解[53]。 6.4 微生物降解 Palop 等[54] 通过测定 42 种乳酸菌对烯丙基硫 苷的分解，筛选出 3 种能降解该硫苷的菌株，其中 保加利亚乳酸杆菌 Lactobacillus agilis 分解能力最强。 色氨酸 脱硫硫苷 吲哚−3−甲基硫苷或芸薹硫苷 ST5a 1−羟基吲哚−3−亚甲基硫苷 4−羟基吲哚−3−亚甲基硫苷 CYP81F4 CYP81F1, CYP81F2, CYP81F3, 新芸薹硫苷 甲氧基芸薹硫苷 IGMT1, IGMT2 MYB34, MYB51, MYB122, bHLH, Dof 方向线旁边的为催化合成的酶，方向线所指的为产物 The compound beside the direction line is catalytic enzyme, and the compound that the direction line points to is the reaction product 图 2 吲哚族硫苷合成路径 Fig. 2 General scheme for indolic glucosinolate biosynthesis 62 华南农业大学学报 (http://xuebao.scau.edu.cn/zr) 第 40 卷
第5期 雷建军,等:硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 63 7影响硫苷生物合成的因素 青花菜芽苗菜比成熟的青花菜更具营养价值 Hanlon等同样发现萝卜苗中硫苷含量是成熟的 71基因型 萝卜中硫苷含量的38倍。 Soengas等15报道,蔬菜中的总脂肪族硫苷含 郭丽萍等报道,十字花科蔬菜中硫苷种类和 量,芜菁的最高,其次是油菜,再次是甘蓝、青花菜 含量差异较大,均以脂肪族硫苷为主,芽苗菜中总 和白菜。司雨等报道了芥蓝品种间硫苷含量的硫苷和每种硫苷含量均显著高于其成熟蔬菜:市售 差异,基因型之间差异很大。硫苷的配合力在基因的萝卜肉质根和芽苗菜异硫氰酸酯含量最高,所测 型之间的差异也很大。萝卜硫素在青花菜中的质芽苗菜中异硫氰酸酯含量约是肉质根的31-62倍。 量分数(以干质量计)为045mg1,在红甘 Rangkadilok等的结果与此类似 蓝中为06-74mgg 马永华等报道,小白菜八叶期的总硫苷含量 7.2发育阶段、器官和部位 明显高于四叶期和十二叶期,脂肪族硫苷含量随叶 不同发育阶段和器官硫苷含量的差异研究有期升高呈下降趋势,吲哚族、芳香族硫苷变化趋势 很多报道,总体来说具有发育阶段的特异性和器官与总硫苷变化趋势一致:小白菜八叶期内叶位总硫 特异性。马永华等报道了小白菜叶期和叶位的苷含量高于外叶位,菜心部位硫苷质量摩尔浓度最 差异。 Bellostas等测定了5种十字花科蔬菜种子高,为435molg,其中脂肪族硫苷质量摩尔浓度 发芽后硫苷含量的变化,发芽4d时只有紫甘蓝的高达255 umol.g2,吲哚族硫苷质量摩尔浓度高达 总硫苷含量略微增加,其他4种蔬菜中硫苷含量下1.60μmog-,芳香族硫苷含量相对较低;此外,叶 降,而在发芽7d时甘蓝和花椰菜中总硫苷含量较位Y7吲哚族硫苷占比最高,占总硫苷的567%,其 4d芽苗菜中硫苷含量增加,就脂肪族硫苷而言,种他叶位则以脂肪族硫苷为主,占总硫苷的590% 子中萝卜硫苷含量最高,紫甘蓝种子中萝卜硫苷质79.0%。在所有叶位中,芳香族硫苷含量最低,占比 量摩尔浓度达到73 umol- g. Pereira等通过研低于71%。 究青花菜在发芽6-11ld的过程中硫苷含量的变化73外界环境条件 发现,随着发芽时间的不断延长硫苷含量整体呈下73.1温度28℃和60%相对湿度最有利于大白 降趋势,如在30℃/5℃(白昼/黑夜)下发芽的青菜硫苷的积累。 Bohinc等指出空气温度对硫 花菜,其硫苷质量摩尔浓度由817molg下降至苷含量有较大的影响,并且相比脂肪族和芳香族硫 36Iμmolg(以干质量计)。 Rychlik等同样发现苷,吲哚族硫苷更容易受到环境因素的影响。在30℃/ 青花菜发芽2d后,硫苷质量摩尔浓度由50 mmol-kg15℃昼夜温度下花椰菜的硫苷含量要明显高于昼 下降至38 mmol- kg(以干质量计)。 Martinez-夜温度为22℃/15℃和18℃2℃。Kisn等m villaluenga等经测定3种青花菜和2种萝卜发芽研究了温度对拟南芥硫苷含量的影响,结果表明, 过程中硫苷含量的变化发现,与种子相比,发芽后对于大多数材料来说15和9℃条件下,硫苷含量 其总硫苷含量均下降,且不同时期的芽苗其硫苷含比21℃下更高,尤其是脂肪族硫苷,基因型之间有 量也有很大差异,如硫苷质量摩尔浓度(以干质量差异,世代之间不稳定。 计)在萝卜种子中为14528molg,而在发芽3d732光照条件 Zheng等四报道100pmom2s 时为10196μmolg’,在发芽4和5d时硫苷含量蓝光有利于硫苷的合成(总硫苷含量比对照、50和 变化不大,硫苷质量摩尔浓度约为143.00 umol: g.150μmom-2s-的都高)。 Groenbaek等报道,用 即使与种子中硫苷含量相比芽苗菜中有所下降,但高蓝光(蓝、红光分别为31.7%和663%)和低蓝光 作为蔬菜食用的芽苗菜其硫苷含量较成熟的蔬菜(蓝、红光分别为148%和813%)对油菜芽(发芽6d 高,如Tian等报道青花菜芽苗菜中3-甲基亚砜后)的硫苷含量几乎没有影响,但对幼苗(发芽11d 基丙基硫苷、2-羟基-3-烯丁基硫苷、烯丁基硫苷、后)有影响,高蓝光可以降低2-羟基-3-丁烯基硫 烯丙基硫苷、4-甲硫基丁基硫苷、1-甲氧基吲哚-苷(有害硫苷)的含量。但对其他硫苷没有影响。在 3-甲基硫苷、4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷和4-甲基此之前也有报道表明,蓝光比红光更能促进油菜芽 亚砜基丁基硫苷(萝卜硫苷)的含量均比成熟的的新葡萄糖芸苔素的合成。21d龄青花菜幼苗 青花菜花球中高,花球中总硫苷质量摩尔浓度为在20%比80%蓝、红光条件下,4-甲氧基芸苔素硫 208μmolg(以鲜质量计)而青花菜芽苗菜中总硫苷的含量明显高于5%比95%蓝、红光,但LED等 苷质量摩尔浓度为402μmolg(以鲜质量计),可见光照比荧光灯/炽灯光照更能促进硫苷的合成和
7 影响硫苷生物合成的因素 7.1 基因型 Soengas 等[55] 报道，蔬菜中的总脂肪族硫苷含 量，芜菁的最高，其次是油菜，再次是甘蓝、青花菜 和白菜。司雨等[23] 报道了芥蓝品种间硫苷含量的 差异，基因型之间差异很大。硫苷的配合力在基因 型之间的差异也很大[56]。萝卜硫素在青花菜中的质 量分数 (以干质量计) 为 0.4~9.5 mg·g−1[57-58] ，在红甘 蓝中为 0.6~7.4 mg·g−1[59]。 7.2 发育阶段、器官和部位 不同发育阶段和器官硫苷含量的差异研究有 很多报道，总体来说具有发育阶段的特异性和器官 特异性。马永华等[60] 报道了小白菜叶期和叶位的 差异。Bellostas 等[61] 测定了 5 种十字花科蔬菜种子 发芽后硫苷含量的变化，发芽 4 d 时只有紫甘蓝的 总硫苷含量略微增加，其他 4 种蔬菜中硫苷含量下 降，而在发芽 7 d 时甘蓝和花椰菜中总硫苷含量较 4 d 芽苗菜中硫苷含量增加，就脂肪族硫苷而言，种 子中萝卜硫苷含量最高，紫甘蓝种子中萝卜硫苷质 量摩尔浓度达到 7.3 μmol·g−1。Pereira 等[62] 通过研 究青花菜在发芽 6~11 d 的过程中硫苷含量的变化 发现，随着发芽时间的不断延长硫苷含量整体呈下 降趋势，如在 30 ℃/15 ℃ (白昼/黑夜) 下发芽的青 花菜，其硫苷质量摩尔浓度由 81.7 μmol·g−1 下降至 36.1 μmol·g−1(以干质量计)。Rychlik 等[63] 同样发现 青花菜发芽 2 d 后，硫苷质量摩尔浓度由 50 mmol·kg−1 下降至 38 mmol·kg − 1 (以干质量计)。Martinezvillaluenga 等[64] 经测定 3 种青花菜和 2 种萝卜发芽 过程中硫苷含量的变化发现，与种子相比，发芽后 其总硫苷含量均下降，且不同时期的芽苗其硫苷含 量也有很大差异，如硫苷质量摩尔浓度 (以干质量 计) 在萝卜种子中为 145.28 μmol·g−1，而在发芽 3 d 时为 101.96 μmol·g−1，在发芽 4 和 5 d 时硫苷含量 变化不大，硫苷质量摩尔浓度约为 143.00 μmol·g−1。 即使与种子中硫苷含量相比芽苗菜中有所下降，但 作为蔬菜食用的芽苗菜其硫苷含量较成熟的蔬菜 高，如 Tian 等[65] 报道青花菜芽苗菜中 3−甲基亚砜 基丙基硫苷、2−羟基−3−烯丁基硫苷、烯丁基硫苷、 烯丙基硫苷、4−甲硫基丁基硫苷、1−甲氧基吲哚− 3−甲基硫苷、4−甲氧基吲哚−3−甲基硫苷和 4−甲基 亚砜基丁基硫苷 (萝卜硫苷) 的含量均比成熟的 青花菜花球中高，花球中总硫苷质量摩尔浓度为 2.08 μmol·g−1(以鲜质量计)，而青花菜芽苗菜中总硫 苷质量摩尔浓度为 4.02 μmol·g−1(以鲜质量计)，可见 青花菜芽苗菜比成熟的青花菜更具营养价值。 Hanlon 等[66] 同样发现萝卜苗中硫苷含量是成熟的 萝卜中硫苷含量的 3.8 倍。 郭丽萍等[67] 报道，十字花科蔬菜中硫苷种类和 含量差异较大，均以脂肪族硫苷为主，芽苗菜中总 硫苷和每种硫苷含量均显著高于其成熟蔬菜；市售 的萝卜肉质根和芽苗菜异硫氰酸酯含量最高，所测 芽苗菜中异硫氰酸酯含量约是肉质根的 31~62 倍。 Rangkadilok 等[68] 的结果与此类似。 马永华等[60] 报道，小白菜八叶期的总硫苷含量 明显高于四叶期和十二叶期，脂肪族硫苷含量随叶 期升高呈下降趋势，吲哚族、芳香族硫苷变化趋势 与总硫苷变化趋势一致；小白菜八叶期内叶位总硫 苷含量高于外叶位，菜心部位硫苷质量摩尔浓度最 高，为 4.35 μmol·g−1，其中脂肪族硫苷质量摩尔浓度 高达 2.55 μmol·g−1，吲哚族硫苷质量摩尔浓度高达 1.60 μmol·g−1，芳香族硫苷含量相对较低；此外，叶 位 Y7 吲哚族硫苷占比最高，占总硫苷的 56.7%，其 他叶位则以脂肪族硫苷为主，占总硫苷的 59.0%~ 79.0%。在所有叶位中，芳香族硫苷含量最低，占比 低于 7.1%。 7.3 外界环境条件 7.3.1 温度 28 ℃ 和 60% 相对湿度最有利于大白 菜硫苷的积累[69]。Bohinc 等[70] 指出空气温度对硫 苷含量有较大的影响，并且相比脂肪族和芳香族硫 苷, 吲哚族硫苷更容易受到环境因素的影响。在 30 ℃/ 15 ℃ 昼夜温度下花椰菜的硫苷含量要明显高于昼 夜温度为 22 ℃/15 ℃ 和 18 ℃/12 ℃。Kissen 等[71] 研究了温度对拟南芥硫苷含量的影响，结果表明， 对于大多数材料来说 15 和 9 ℃ 条件下，硫苷含量 比 21 ℃ 下更高，尤其是脂肪族硫苷，基因型之间有 差异，世代之间不稳定。 7.3.2 光照条件 Zheng 等[72] 报道 100 μmol·m–2·s–1 蓝光有利于硫苷的合成 (总硫苷含量比对照、50 和 150 μmol·m–2·s–1 的都高)。Groenbaek 等[73] 报道，用 高蓝光 (蓝、红光分别为 31.7% 和 66.3%) 和低蓝光 (蓝、红光分别为 14.8% 和 81.3%) 对油菜芽 (发芽 6 d 后) 的硫苷含量几乎没有影响，但对幼苗 (发芽 11 d 后) 有影响，高蓝光可以降低 2−羟基−3−丁烯基硫 苷 (有害硫苷) 的含量。但对其他硫苷没有影响。在 此之前也有报道表明，蓝光比红光更能促进油菜芽 的新葡萄糖芸苔素的合成[62]。21 d 龄青花菜幼苗 在 20% 比 80% 蓝、红光条件下，4−甲氧基芸苔素硫 苷的含量明显高于 5% 比 95% 蓝、红光，但 LED 等 光照比荧光灯/白炽灯光照更能促进硫苷的合成和 第 5 期 雷建军，等：硫苷及其生物合成分子生物学机理研究进展 63