生物工程学报 李欢欢等基于 CRISPR-Cask的功能基因筛选研究进展461 Chinese Journal of Biotechnology http:/ljournals.im.ac.cn/cjbcn Apr.25,2018,34(4):461-472 Do:10.13345/cjb.170348 @2018 Chin J Biotech, All rights reserved 综述 基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展 李欢欢,黄承浩 厦门大学生命科学学院分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,福 建厦门361102 李欢欢,黄承浩.基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展.生物工程学报,2018,34(4):461-472 Li HH, Huang CH Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Chin J Biotech, 2018, 34(4): 461-472 摘要:功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法,在生物、医药、新 治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。 CRISPR-Cas9( Clustered regularly interspaced short palindromic peat sequences/CRISPR- associated protein9)技术作为近期热门的基因编辑工具,能够高通量地对基因组进行精 准修饰,为实现功能性基因的筛选提供了简便髙效的技术攴持。文中对 CRISPR-εas9技术应用于功能性基因筛选 的方法及研究进展进行了综述, 关键词: CRISPR-Cas9,基因敲除文库,功能性基因筛选 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Huanhuan Li, and Chenghao Huang National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China Abstract: Functional genetic screening as an important method for exploring biological processes, diseases development research and functional annotation of genetic elements, has been widely used in pharmaceutical research, new therapeutic targets identifying and screening, and tumor resistance. CRISPR-Cas 9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) is the newest tool in the geneticists toolbox, allowing researchers to edit genome with unprecedented ease, accuracy and high-throughput. CRISPR-Cas9 system provides a high-throughput, practical and efficient tool for the discovery of functionally important genes responsible for certain phenotypes. In this review, we ummarize the characterization of CRISPR/Cas system and applications of this new genetic toolkit in functional genetic Keywords: CRISPR/Cas9, genome-scale knockout library, functional genetic sc Received: September 6, 2017; Accepted: October 30, 2017 Supported by: National Natural Science Foundation of China(No. 8157199 Corresponding author: Chenghao Huang. E-mail: huangchenghao @xmuedr 国家自然科学基金(No.81571990)资助。 网络出版时间:2017-11-07 网络出版地址:htp:/ kns cnki. net/kcms/ detail/1.19980.20171107.1703.003html
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http://journals.im.ac.cn/cjbcn Apr. 25, 2018, 34(4): 461−472 DOI: 10.13345/j.cjb.170348 ©2018 Chin J Biotech, All rights reserved Received: September 6, 2017; Accepted: October 30, 2017 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81571990). Corresponding author: Chenghao Huang. E-mail: huangchenghao@xmu.edu.cn 国家自然科学基金 (No. 81571990) 资助。 网络出版时间：2017-11-07 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20171107.1703.003.html 生物工程学报 461 基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 李欢欢，黄承浩 厦门大学生命科学学院 分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福 建 厦门 361102 李欢欢, 黄承浩. 基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展. 生物工程学报, 2018, 34(4): 461–472. Li HH, Huang CH. Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system. Chin J Biotech, 2018, 34(4): 461–472. 摘 要: 功能性基因的筛选是探索生物进程、研究疾病发生发展和诠释基因功能的重要方法，在生物、医药、新 治疗靶点筛选及肿瘤耐药等方面有广泛的应用。CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) 技术作为近期热门的基因编辑工具，能够高通量地对基因组进行精 准修饰，为实现功能性基因的筛选提供了简便高效的技术支持。文中对 CRISPR-cas9 技术应用于功能性基因筛选 的方法及研究进展进行了综述。 关键词: CRISPR-Cas9，基因敲除文库，功能性基因筛选 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Huanhuan Li, and Chenghao Huang National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Dciseases, State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China Abstract: Functional genetic screening as an important method for exploring biological processes, diseases development research and functional annotation of genetic elements, has been widely used in pharmaceutical research, new therapeutic targets identifying and screening, and tumor resistance. CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9) is the newest tool in the geneticist’s toolbox, allowing researchers to edit genome with unprecedented ease, accuracy and high-throughput. CRISPR-Cas9 system provides a high-throughput, practical and efficient tool for the discovery of functionally important genes responsible for certain phenotypes. In this review, we summarize the characterization of CRISPR/Cas9 system and applications of this new genetic toolkit in functional genetic screening. Keywords: CRISPR/Cas9, genome-scale knockout library, functional genetic screening ·综 述·
ISSN1000-3061CN11-1998Q生物工程学报 Chin J Biotech 随着科学技术的发展,人类基因组计划初能完全抑制基因表达,因此其造成的表型变化不 步完成,人们对基因的功能也有了一定的认识,够稳定明显,影响对基因功能的判定。此外, 但是仍然有更多的问题亟待探索,例如基因与疾细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着 病发生发展的关系,基因与肿瘤耐药性的关系广泛的脱靶效应,成为影响RNAi文库筛选的 等。如何利用人类基因组以及已有的技术手段研另一个重要问题。近年来 CRISPR-Cas9技术大放 究疾病发生发展过程,寻找与疾病和健康相关的异彩,可以用于酵母菌、哺乳动物细胞、斑马 功能性基因,从而建立新的疾病诊断预防和治疗鱼、水稻門、小鼠等各类细胞及生物体的基 方法,发现新的治疗靶点及开发新的药物,是科因编辑,科学家们也开始利用 CRISPR-Cas9技术 学家们关注的热点。高通量功能性基因筛选以基进行功能性基因的筛选。 CRISPR-Cas9技术既可 因编辑技术为基础,通过在全基因组范围内干扰通过诱导基因突变进行功能缺失型( Loss-of- 基因功能来筛选目的表型,是剖析基因功能、探 function)筛选,又可通过激活转录进行功能获得 索生物进程和疾病的重要工具。近年来,随着基型(Gain- of-function)筛选,不仅可以作用于基因 因编辑技术的发展和成熟,功能性基因筛选也随的编码区,还可以靶向基因非编码区山,与RNAi 之变得更加简便高效,在生命科学的研究中发挥技术相比具有相对较低的脱靶效率和更广泛的 了重要作用。本文主要介绍应用 CRISPR-Cas9作用位点,因而逐渐成为功能性基因筛选的热点 文库进行功能性基因筛选的方法及目前的研究方法。 进展 筛选功能性基因的常用策略主要分为功能获1 CRISPR-Cas9:精准的基因编辑技术 得型(Gain- of-function)筛选和功能缺失型(Loss CRISPR-Cas是广泛存在于细菌和古菌中的获 of-function)筛选。功能获得型筛选策略通常利用得性免疫系统,能够剪切外源基因,抵御病毒对细 DNA文库使基因过表达来筛选功能性基因。菌的入侵12,最早由 Ishino等发现于1987年 由于细胞转录组非常复杂,难以构建覆盖整个细直到2010年 CRISPR的机制和功能才被研究清 胞基因组的cDNA文库,导致cDNA文库的库容楚4。目前被发现的 CRISPR系统有3种类型 量有限;此外,cDNA的表达并不受细胞内在调均由3种元件组成:一簇 CRISPR相关基因(Cas)、 控,因此经常会出现基因异常高表达,影响对结非编码RNA以及一列重复序列。Cas基因可以 果的判断,这些都限制了cDNA文库在功能性基和核酸酶、解旋酶、聚合酶结合,是 CRISPR-Cas 因筛选中的应用。功能缺失型( Loss-of- function)系统中执行剪切功能的元件1。一系列短重复序 筛选策略是通过抑制基因表达或基因敲除来筛选列被来源于外源基因的间隔序列( Protospacer) 功能性基因。RNAi是真核生物细胞内广泛存在的隔开,共同构成了 CRISPR RNA( rrNA)阵列。 生物进程,通过 SiRNA介导其同源RNA降解实通常间隔序列与前间区序列邻近基序(PAM)相 现抑制靶基因表达的作用2,因而曾被广泛应用连。不同物种PAM序列不同,例如目前在哺 于高通量的功能缺失型基因筛选。与CDNA文乳动物细胞中应用广泛的spCa9识别5NGG 库相比,RNAi文库筛选具有高通量、简便、经济、PAM序列,而在细胞基因组中平均8-12bp就有 高效的优点,但是其仍然存在难以忽视的问题。这样的序列出现102。基因组中广泛存在的PAM RNAi技术是降低基因表达水平来影响表型,并不序列为 CRISPR-Cas9基因编辑技术应用于全基因 http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 462 随着科学技术的发展，人类基因组计划初 步完成，人们对基因的功能也有了一定的认识， 但是仍然有更多的问题亟待探索，例如基因与疾 病发生发展的关系，基因与肿瘤耐药性的关系 等。如何利用人类基因组以及已有的技术手段研 究疾病发生发展过程，寻找与疾病和健康相关的 功能性基因，从而建立新的疾病诊断预防和治疗 方法，发现新的治疗靶点及开发新的药物，是科 学家们关注的热点。高通量功能性基因筛选以基 因编辑技术为基础，通过在全基因组范围内干扰 基因功能来筛选目的表型，是剖析基因功能、探 索生物进程和疾病的重要工具。近年来，随着基 因编辑技术的发展和成熟，功能性基因筛选也随 之变得更加简便高效，在生命科学的研究中发挥 了重要作用。本文主要介绍应用 CRISPR-Cas9 文库进行功能性基因筛选的方法及目前的研究 进展。 筛选功能性基因的常用策略主要分为功能获 得型 (Gain-of-function) 筛选和功能缺失型 (Lossof-function) 筛选。功能获得型筛选策略通常利用 cDNA 文库使基因过表达来筛选功能性基因[1]。 由于细胞转录组非常复杂，难以构建覆盖整个细 胞基因组的 cDNA 文库，导致 cDNA 文库的库容 量有限；此外，cDNA 的表达并不受细胞内在调 控，因此经常会出现基因异常高表达，影响对结 果的判断，这些都限制了 cDNA 文库在功能性基 因筛选中的应用。功能缺失型 (Loss-of-function) 筛选策略是通过抑制基因表达或基因敲除来筛选 功能性基因。RNAi 是真核生物细胞内广泛存在的 生物进程，通过 siRNA 介导其同源 RNA 降解实 现抑制靶基因表达的作用[2]，因而曾被广泛应用 于高通量的功能缺失型基因筛选[3]。与 cDNA 文 库相比，RNAi 文库筛选具有高通量、简便、经济、 高效的优点，但是其仍然存在难以忽视的问题。 RNAi 技术是降低基因表达水平来影响表型，并不 能完全抑制基因表达，因此其造成的表型变化不 够稳定明显，影响对基因功能的判定[4]。此外， 细胞内源性的 RNAi 途径导致 RNAi 筛选存在着 广泛的脱靶效应[5]，成为影响 RNAi 文库筛选的 另一个重要问题。近年来 CRISPR- Cas9 技术大放 异彩，可以用于酵母菌[6]、哺乳动物细胞[7]、斑马 鱼[8]、水稻[9]、小鼠[10]等各类细胞及生物体的基 因编辑，科学家们也开始利用 CRISPR-Cas9 技术 进行功能性基因的筛选。CRISPR-Cas9 技术既可 通过诱导基因突变进行功能缺失型 (Loss-offunction) 筛选，又可通过激活转录进行功能获得 型 (Gain-of-function) 筛选，不仅可以作用于基因 的编码区，还可以靶向基因非编码区[11]，与 RNAi 技术相比具有相对较低的脱靶效率和更广泛的 作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点 方法。 1 CRISPR-Cas9：精准的基因编辑技术 CRISPR-Cas 是广泛存在于细菌和古菌中的获 得性免疫系统，能够剪切外源基因，抵御病毒对细 菌的入侵[12]，最早由 Ishino 等发现于 1987 年[13]， 直到 2010 年 CRISPR 的机制和功能才被研究清 楚[14-16]。目前被发现的 CRISPR 系统有 3 种类型， 均由 3种元件组成：一簇 CRISPR相关基因 (Cas)、 非编码 RNA 以及一列重复序列[17]。Cas 基因可以 和核酸酶、解旋酶、聚合酶结合，是 CRISPR-Cas 系统中执行剪切功能的元件[18]。一系列短重复序 列被来源于外源基因的间隔序列 (Protospacer) 隔开，共同构成了 CRISPR RNA (crRNA) 阵列。 通常间隔序列与前间区序列邻近基序 (PAM) 相 连[19]。不同物种 PAM 序列不同，例如目前在哺 乳动物细胞中应用广泛的 spCas9 识别 5′-NGG PAM 序列，而在细胞基因组中平均 8–12 bp 就有 这样的序列出现[20-21]。基因组中广泛存在的 PAM 序列为 CRISPR-Cas9 基因编辑技术应用于全基因
李欢欢等基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展(463 组提供了可能。基因座上游是一段几百bp的非编基因的表达。 CRISPR激活 CRISPR activation 码基因,被命名为前导序列8。 CRISPR-Cas系 CRISPRa)是利用dCa9和转录激活因子协作上 统中最常用于基因编辑的是Ⅱ型 CRISPR-Cas系调靶基因表达水平,可以被应用于功能获得型 统,由Cas9核酸酶、 rrnA和反式激活 rrNA筛选{2。 ( tracrRNA)三部分组成12执行基因剪切功能 时,首先是cRNA转录为 pre-crRNA,同时与2 CRISPR-Ca9基因文库 rrNA互补的 tracrRNA也进行转录并激活Cas92.1基因文库设计 及特异性的RNA核酸酶对pre- rrNA进行加工, 目前研究者们已对如何将 CRISPR-Cas9系统 成熟的 rrNA与 tracrrNa及Cas9核酸酶形成复应用于功能性基因筛选进行了多种尝试并取得了 合体,进而在向导RNA的指导下靶向特定位点进成功(表1),为后来者提供了大量的经验和指导。 行切割23。研究者们将密码子优化的Cas9和必要 CRISPR-Cas9功能性基因筛选平台首先需要有能 的RNA元件在哺乳动物细胞中进行异源重组表够满足实验者需求的 CRISPR-Cas9文库。有效的 达,并将cRNA和 tracrRNA融合表达形成一条嵌gRNA是决定 CRISPR-Cas9功能性基因筛选成功 合单链向导RNA( SgRNA門2,精简了 CRISPR-Cas9的关键因素,因此首先要设计针对全基因组的 系统的结构,极大地提高了 CRISPR-Cas9系统应 SgRNA。设计 SgRNA要考虑两点:一是Cas9作用 用于基因编辑的可行性,使其更加便捷高效。在必需的PAM序列,二是降低脱靶效率。研究者 CRISPR-Cas9系统中, SgRNA和紧接着 SeRNA们开发了多种用于设计 SgRNA的平台。 Chuai等P 的PAM是决定基因编辑准确性的关键因素。总结了当前的36个设计 SgRNA的网站,并根据平 SgRNA长20nt,通过与靶序列互补配对引导Ca9台设计规则将其分为3类:1) Alignment-based:单 准确定位于靶基因,并在PAM上游约3bp处进纯依据PAM位置设计及评分;2) Hypothesis- 行DNA双链剪切1。断裂双链(DSBs)的 DNA driven:依据GC含量、外显子位置等因素对 损伤修复途径主要有以下两种:缺少修复模板时, SgRNA效率的作用设计及评分;3) Learning- 断裂双链通过非同源末端连接( Nonhomologous based:利用考虑影响 SgRNa效率的不同特点的 end joining,NHEJ)途径重新连接,这种过程容训练模式设计及评分。其中第二、三类平台在设 易产生插入或缺失突变使基因功能丧失,因而被计时考虑了不同序列和染色质特点,相比第一类 应用于基因敲除;当存在同源修复模板时,断裂双平台更加全面高效,使用者可根据不同要求选择 链通过同源直接修复( Homology- directed repair, 适合的平台。设计好的 SgRNA合成后需要连接至 HDR)途径将修复模板重组进断裂部位,常被用合适的慢病毒载体上,Cas9核酸酶既可以和 于基因重组。 CRISPR-Cas99技术除了可以进行 SgRNA构建在同一个质粒上,也可以构建在两 基因敲除,还可以用于基因的上调或下调表达。 个质粒上。将构建好的 SgRNA文库包装成慢病 CRISPR干扰( CRISPR interference, CRISPRI)和毒,并以低MOl(通常为03-0.5)感染细胞构建 RNAi功能相似,是在 CRISPR技术基础上改造而稳定细胞株29,避免同一细胞多个基因同时被敲 来的,将Cas9突变使其丧失活性( dead cas9, 除对结果造成影响。 dCas9)无法对双链DNA进行切割,再与转录抑2.2常用筛选方式 制因子联合作用,即可在 SgRNA指导下抑制特定 CRISPR-Cas9文库高通量筛选常用模式可以 :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 463 组提供了可能。基因座上游是一段几百 bp 的非编 码基因，被命名为前导序列[18]。CRISPR-Cas 系 统中最常用于基因编辑的是Ⅱ型 CRISPR-Cas 系 统，由 Cas9 核酸酶、crRNA 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 三部分组成[22]。执行基因剪切功能 时，首先是 crRNA 转录为 pre-crRNA，同时与 crRNA 互补的 tracrRNA 也进行转录并激活 Cas9 及特异性的 RNA 核酸酶对 pre-crRNA 进行加工， 成熟的 crRNA 与 tracrRNA 及 Cas9 核酸酶形成复 合体，进而在向导 RNA 的指导下靶向特定位点进 行切割[23]。研究者们将密码子优化的 Cas9 和必要 的 RNA 元件在哺乳动物细胞中进行异源重组表 达[24]，并将 crRNA 和 tracrRNA 融合表达形成一条嵌 合单链向导 RNA (sgRNA)[25]，精简了 CRISPR-Cas9 系统的结构，极大地提高了 CRISPR-Cas9 系统应 用于基因编辑的可行性，使其更加便捷高效。在 CRISPR-Cas9 系统中，sgRNA 和紧接着 sgRNA 的 PAM 是决定基因编辑准确性的关键因素。 sgRNA 长 20 nt，通过与靶序列互补配对引导 Cas9 准确定位于靶基因，并在 PAM 上游约 3 bp 处进 行 DNA 双链剪切[17]。断裂双链 (DSBs) 的 DNA 损伤修复途径主要有以下两种：缺少修复模板时， 断裂双链通过非同源末端连接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 途径重新连接，这种过程容 易产生插入或缺失突变使基因功能丧失，因而被 应用于基因敲除；当存在同源修复模板时，断裂双 链通过同源直接修复 (Homology- directed repair， HDR) 途径将修复模板重组进断裂部位，常被用 于基因重组[20]。CRISPR-Cas9 技术除了可以进行 基因敲除，还可以用于基因的上调或下调表达。 CRISPR 干扰 (CRISPR interference，CRISPRi) 和 RNAi 功能相似，是在 CRISPR 技术基础上改造而 来的，将 Cas9 突变使其丧失活性 (dead Cas9， dCas9) 无法对双链 DNA 进行切割，再与转录抑 制因子联合作用，即可在 sgRNA 指导下抑制特定 基因的表达[26]。CRISPR 激活 (CRISPR activation， CRISPRa) 是利用 dCas9 和转录激活因子协作上 调靶基因表达水平，可以被应用于功能获得型 筛选[27]。 2 CRISPR-Cas9 基因文库 2.1 基因文库设计 目前研究者们已对如何将 CRISPR-Cas9 系统 应用于功能性基因筛选进行了多种尝试并取得了 成功 (表 1)，为后来者提供了大量的经验和指导。 CRISPR-Cas9 功能性基因筛选平台首先需要有能 够满足实验者需求的 CRISPR-Cas9 文库。有效的 sgRNA 是决定 CRISPR-Cas9 功能性基因筛选成功 的关键因素，因此首先要设计针对全基因组的 sgRNA。设计 sgRNA 要考虑两点：一是 Cas9 作用 必需的 PAM 序列，二是降低脱靶效率[17]。研究者 们开发了多种用于设计 sgRNA 的平台。Chuai 等[28] 总结了当前的 36 个设计 sgRNA 的网站，并根据平 台设计规则将其分为 3 类：1) Alignment-based：单 纯依据 PAM 位置设计及评分；2) Hypothesisdriven：依据 GC 含量、外显子位置等因素对 sgRNA 效率的作用设计及评分；3) Learningbased：利用考虑影响 sgRNA 效率的不同特点的 训练模式设计及评分。其中第二、三类平台在设 计时考虑了不同序列和染色质特点，相比第一类 平台更加全面高效，使用者可根据不同要求选择 适合的平台。设计好的 sgRNA 合成后需要连接至 合适的慢病毒载体上，Cas9 核酸酶既可以和 sgRNA 构建在同一个质粒上[29]，也可以构建在两 个质粒上[30]。将构建好的 sgRNA 文库包装成慢病 毒，并以低 MOI (通常为 0.3–0.5) 感染细胞构建 稳定细胞株[29]，避免同一细胞多个基因同时被敲 除对结果造成影响。 2.2 常用筛选方式 CRISPR-Cas9 文库高通量筛选常用模式可以
64ISsN10003061CN11-1998Q生物工程学报 Chin j Biotech 表1 CRISPR-Cas9系统在功能基因筛选中的应用 Table 1 Functional genetic screening using CRISPR-Cas system SgRNAS RNAs/gene Reference perturbation Cell type(s) Selection Human 64 751 10808 KO Resistance to Vemurafenib uman 73 151 711410 KO KBM7 Resistance to [34] Human 869 ela Resistance to diphtheria Resistance to chimaeric anthrax Human 91 320 172326 HPAF-Ⅱ Proliferation Human 23652 HELA A549 Proliferation 293T Mouse 67405 206113 NSCLC Proliferation Human 77 406 201213-4 KO Resistance to WNV [39] Human 187536 1854310 GXRCas9 Resistance to HIV [40] 234303 Activation A549 Resistance to IAV [41] Human l831 NF1:6682NF2:6934 A375 Resistance to 43] CUL3:4699 Vemurafenib Human 1247 67 Huh7.5 44] Human HBEl 28150 K562 Protein expression [45] 10739 HER2 Human 123 411 190506 CEM T Antigen antibody Raji/CD4B interactions 87897 1-5 KO IBMDMS GSDMD 49] 分为阳性筛选( Positive selection screen)和阴性果分析的平台。例如 MAGeCK是Li等开发的 筛选( Negative selection screen)。阳性筛选是用来分析 CRISPR高通量筛选结果的算法,之后 对已成功整合 SgRNA的细胞文库施加一定的筛L等又将其拓展为 MAGeCK-VISPR算法,为 选压力,仅使少数目的表型的细胞能够存活,达 CRISPR高通量筛选提供了综合质控、分析及可 到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反,存视化的数据分析方法。 活的细胞并不是目的表型细胞,因此需要比较不 同时间点 SgRNA的丰度找出差异gRNA来确定3 CRISPR-Cas9文库应用于功能性基因 关键基因。两种筛选方式通常都需要与高通量测筛选的研究进展 序技术结合,通过高通量测序获得样品中细胞的31药物作用基因筛选 SgRNA序列信息,再通过生物信息学分析排除假 CRISPR-Cas9文库早期应用于药物作用基因 阳性结果继而确定可能的候选基因(图1)。筛选的尝试较多。 Vemurafenib是突变的蛋白激酶 CRISPR系统后续分析同样是影响实验结果的重BRAF的抑制剂,被批准用于晚期黑色素瘤的治 要问题, Chuai等同样整理了7种用于后续结疗,对存在V600 E BRAF突变的黑色素瘤有治疗 http://jourmals.im.ac.cn/cjben
ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http://journals.im.ac.cn/cjbcn 464 表 1 CRISPR-Cas9 系统在功能基因筛选中的应用 Table 1 Functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system Species sgRNAs Target genes sgRNAs/gene Type of perturbation Cell type(s) Selection Reference Human 64 751 10 808 3–4 KO A375 Resistance to Vemurafenib [9] Human 73 151 7 114 10 KO KBM7 Resistance to 6-thioguanine [34] Human 869 291 2–3 KO HeLa Resistance to diphtheria Resistance to chimaeric anthrax [35] Human 91 320 17 232 6 KO HPAF-Ⅱ Proliferation [36] Human 23 652 73 3 KO HELA A549 293T Proliferation [37] Mouse 67 405 20 611 3 KO NSCLC Proliferation [38] Human 77 406 20 121 3–4 KO 293FT Resistance to WNV [39] Human 187 536 18 543 10 KO GXRCas9 Resistance to HIV [40] Human 70 290 23 430 3 Activation A549 Resistance to IAV [41] Human 18 315 NF1: 6 682 NF2: 6 934 CUL3: 4 699 KO A375 Resistance to Vemurafenib [43] Human 12 472 671 20 KO Huh7.5 Proliferation [44] Human HBE1 10 739 HER2 12 189 281 433 50 30 Activation K562 Protein expression [45] Human 123 411 19 050 6 KO CEM T Raji/CD4 B Antigen antibody interactions [48] Mouse 87 897 19 150 1–5 KO iBMDMs GSDMD [49] 分为阳性筛选 (Positive selection screen) 和阴性 筛选 (Negative selection screen)[30]。阳性筛选是 对已成功整合 sgRNA 的细胞文库施加一定的筛 选压力，仅使少数目的表型的细胞能够存活，达 到富集关键基因的目的。阴性筛选与之相反，存 活的细胞并不是目的表型细胞，因此需要比较不 同时间点 sgRNA 的丰度找出差异 sgRNA 来确定 关键基因。两种筛选方式通常都需要与高通量测 序技术结合，通过高通量测序获得样品中细胞的 sgRNA 序列信息，再通过生物信息学分析排除假 阳性结果继而确定可能的候选基因 (图 1)。 CRISPR 系统后续分析同样是影响实验结果的重 要问题，Chuai 等[28]同样整理了 7 种用于后续结 果分析的平台。例如 MAGeCK 是 Li 等[31]开发的 用来分析 CRISPR 高通量筛选结果的算法，之后 Li 等又将其拓展为 MAGeCK-VISPR 算法[32]，为 CRISPR 高通量筛选提供了综合质控、分析及可 视化的数据分析方法。 3 CRISPR-Cas9 文库应用于功能性基因 筛选的研究进展 3.1 药物作用基因筛选 CRISPR-Cas9 文库早期应用于药物作用基因 筛选的尝试较多。Vemurafenib 是突变的蛋白激酶 BRAF 的抑制剂，被批准用于晚期黑色素瘤的治 疗，对存在 V600E BRAF 突变的黑色素瘤有治疗
李欢欢等基于 CRISPR-Cas9的功能基因筛选研究进展(465 Selection Deep sequencing remaining sgRNA Contro Deep sequencing gRNA library LenticrISPR library selection Selection Deep sequencing Campare change in III sgRNA counts 图 I CRISPR-Cas9系统功能基因筛选流程 Fig. 1 Flowchart of functional genetic screening using CRISPR-Cas 9 system 效果。 Shalem等设计了靶向全基因组18080个且每个基因至少设计了10条 SeRNA以确保文库 基因,包含64751条 sgRNA的 CRISPR-Cas9基因的 knockout效率。与 Shalem的方法略有差别的 敲除文库,并命名为 GeCKo( Genome- scale是,wang等并未采用单质粒的慢病毒载体系统 CRISPR-Cas9 knockout)文库。 Shalen等利用慢病而是先构建稳定表达Cas9的KBM7细胞,再转 毒载体将 GeCKo文库转染进有V600 E BRAF突染了整个 SgRNA文库。与单质粒系统相比,双质 变的黑色素瘤细胞A375中,加入 Vemurafenib抑粒系统可以通过挑选高效的Cas9表达细胞株来 制A375细胞生长,从而富集少数具有 Vemurafenib提高文库的 knockout效率。完成建库工作后研究 药物抗性的细胞。通过对这部分细胞的 SgRNA序者利用6-硫代鸟嘌呤的细胞致死作用,杀死MMR 列进行分析, Shalem等筛选出了n、 medI2、n、通路正常细胞,富集MMR通路突变细胞。对存 cw3、ada2b和 nadal等敲除后能够使细胞对活细胞的 SeRNA测序分析,研究者发现被富集细 lemurafenib产生抗性的基因,其中n/2、cul3、胞的 SgRNA主要靶向MMR通路的4个关键基因 tada2b和 nadal之前尚未被报道过与 Vemurafenib msh2、msh6、mlhl和pms2。 耐药性有关。这些候选基因提出了新的 Vemurafenib gRNA文库的构建是实现功能性基因筛选的 肿瘤耐药杋制假说。研究者还将筛选结果与之前使关键。覆盖全基因的文库虽然更加全面,但是由于 用RNA3筛选 Vemurafenib耐药基因的结果进行库容量庞大,在实际操作过程中需要大量的细胞 比较评估,两者结果高度一致,证明了 CRISPR-Cas9工作量及操作难度均较大。在研究炭疽毒素与白喉 用于功能性基因筛选的可行性。 毒素毒性作用相关基因的工作中,Zhou等3通过 同期,wang及其团队也采用了类似的筛选方对已掌握知识进行整理,挑选出了可能与研究内 式研究了DNA错配修复的相关基因。研究者容相关的291基因,并设计了靶向这291个基因 使用能够引起细胞损伤的核苷类似物6-硫代鸟嘌的包含869条 SgRNA的慢病毒聚焦型人源文库。 呤作为筛选抗性,MMR通路正常的细胞无法修该课题组使用炭疽毒素和白喉毒素分别进行阳性 复6-硫代鸟嘌呤引起的损伤而导致细胞滞留在筛选,经过三轮毒素处理,待对照组细胞全部死 G2-M期无法进行正常的分裂,而MMR缺陷细胞亡后,对实验组存活细胞进行测序分析。除了已 则不能识别这种损伤从而继续进行分裂。Wang等知的炭疽毒素受体 Antar1,研究者还成功鉴定 设计合成了靶向7114个基因的 SeRNA文库,并 penal、pecr、d10和CD8l等与炭疽毒素作用 :010-64807509 X: cjb@imaccn
李欢欢 等/基于 CRISPR-Cas9 的功能基因筛选研究进展 ☏：010-64807509 ：cjb@im.ac.cn 465 图 1 CRISPR-Cas9 系统功能基因筛选流程 Fig. 1 Flowchart of functional genetic screening using CRISPR-Cas9 system. 效果。Shalem 等[29]设计了靶向全基因组 18 080 个 基因，包含 64 751 条 sgRNA 的 CRISPR-Cas9 基因 敲除文库，并命名为 GeCKO (Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout) 文库。Shalem 等利用慢病 毒载体将 GeCKO 文库转染进有 V600E BRAF 突 变的黑色素瘤细胞 A375 中，加入 Vemurafenib 抑 制 A375 细胞生长，从而富集少数具有 Vemurafenib 药物抗性的细胞。通过对这部分细胞的 sgRNA 序 列进行分析，Shalem 等筛选出了 nf1、med12、nf2、 cul3、tada2b 和 tada1 等敲除后能够使细胞对 Vemurafenib 产生抗性的基因，其中 nf2、cul3、 tada2b 和 tada1 之前尚未被报道过与 Vemurafenib 耐药性有关。这些候选基因提出了新的 Vemurafenib 肿瘤耐药机制假说。研究者还将筛选结果与之前使 用 RNAi[33]筛选 Vemurafenib 耐药基因的结果进行 比较评估，两者结果高度一致，证明了CRISPR-Cas9 用于功能性基因筛选的可行性。 同期，Wang 及其团队也采用了类似的筛选方 式研究了 DNA 错配修复的相关基因[34]。研究者 使用能够引起细胞损伤的核苷类似物 6-硫代鸟嘌 呤作为筛选抗性，MMR 通路正常的细胞无法修 复 6-硫代鸟嘌呤引起的损伤而导致细胞滞留在 G2-M 期无法进行正常的分裂，而 MMR 缺陷细胞 则不能识别这种损伤从而继续进行分裂。Wang 等 设计合成了靶向 7 114 个基因的 sgRNA 文库，并 且每个基因至少设计了 10 条 sgRNA 以确保文库 的 knockout 效率。与 Shalem 的方法略有差别的 是，Wang 等并未采用单质粒的慢病毒载体系统， 而是先构建稳定表达 Cas9 的 KBM7 细胞，再转 染了整个 sgRNA 文库。与单质粒系统相比，双质 粒系统可以通过挑选高效的 Cas9 表达细胞株来 提高文库的 knockout 效率。完成建库工作后研究 者利用 6-硫代鸟嘌呤的细胞致死作用，杀死 MMR 通路正常细胞，富集 MMR 通路突变细胞。对存 活细胞的 sgRNA 测序分析，研究者发现被富集细 胞的 sgRNA 主要靶向 MMR 通路的 4 个关键基因 msh2、msh6、mlh1 和 pms2。 sgRNA 文库的构建是实现功能性基因筛选的 关键。覆盖全基因的文库虽然更加全面，但是由于 库容量庞大，在实际操作过程中需要大量的细胞， 工作量及操作难度均较大。在研究炭疽毒素与白喉 毒素毒性作用相关基因的工作中，Zhou 等[35]通过 对已掌握知识进行整理，挑选出了可能与研究内 容相关的 291 基因，并设计了靶向这 291 个基因 的包含 869 条 sgRNA 的慢病毒聚焦型人源文库。 该课题组使用炭疽毒素和白喉毒素分别进行阳性 筛选，经过三轮毒素处理，待对照组细胞全部死 亡后，对实验组存活细胞进行测序分析。除了已 知的炭疽毒素受体 Antxr1，研究者还成功鉴定 plxna1、pecr、fzd10 和 CD81 等与炭疽毒素作用