《安徽农业大学学报》：利用T-RFLP技术在施用解磷菌剂土壤中微生物群落多样性分析（柯春亮、戴嘉欣、周登博、张锡炎）

安徽农业大学学报,2017,44(3):471-477 Journal of Anhui Agricultural University DO10.13610jcnk1672-352x20170524006网络出版时间:2017/5/2411:170 UuRl]hTtp://kns.cnkinet/kcms/detail/34.1162.s.20170524.1117.012.html 利用T-RFLP技术在施用解磷菌剂土壤中 微生物群落多样性分析 柯春亮,戴嘉欣1,周登博2,张锡炎2 (1.广东石油化工学院,茂名525000:2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口571101) 摘要:为探讨解磷微生物菌肥对香蕉土壤根际微生态的影响,利用 T-RFLP( (terminal restriction fragment lens polymorphism)技术分析土壤均匀度指数、香农指数和优势种群等分析微生物多样性,研究高效解磷菌剂与化学磷 肥的不同组合施用方式对香蕉植株的生长情况和根际土壤微生物物量和群落结构的影响。结果显示,与对照CK相 比,T处理组香蕉苗较CK组生长健壮,地上部分鲜重平均值为42.2cm,明显比CK高出35,2%。接M-3-01解磷 细菌处理组T1、T3生长势最为显著(P<0.05),其中,T3株高和茎围分别是CK的1.26、1.16倍。 T-RFLP技术 分析微生物多样性表明,T1、T3多样性指数和均匀度指数指标分别为2.122.11和0.93/0.88,与CCK差异性不 明显,但略微高于CK。同时,分析土壤优势种群,处理组TⅠ、T3处理组土壤优势微生物种群数分别为1和14, 数目基本与处理前土壤CCK的一致,而T2略低于CK。拟柱孢藻( Cylindrospermopsis)和北里孢菌( Kitasatospora) 存在于CK和施用解磷菌剂T1、T3处理土壤中。土壤种植香蕉茴后,不同施用方式对土壤微生物群落丰富度和 多样性的稳定具有积极影响。因此,施用高效解磷菌剂对维持土壤微生物群落丰富度和均匀度效罘较好。 关键词:T-RFLP:解磷菌剂:土壤;微生物;多样性 中图分类号:S1543 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2017)03-0471-07 Microbial community diversity in the soil fertilized with phosphate solubilizing bacteria by terminal restriction fragment length polymorphism analysis KE Chunliang, DAI Jiaxin, ZHOU Dengbo', ZHANG Xiya (1. Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101) Abstract: In order to study the impact of microbial fertilizer on banana soil rhizosphere's micro-ecology, we used T-RFLP technology to analyze Evenness index E, Shannon-Weiner H index and dominant population. We ex- tracted the total DNA from the soil to study the influences of different combinations of efficient phosphorus bacteria and chemical fertilizers on the growth of banana plants and rhizosphere soil microbial community quantity an structure. Compared with the control group, the banana seedling in T treatment groups was more robust with an av erage height of 42.2 cm, 35.2% higher than that of the control group, especially in T treatment groups with M3-01 phosphorus bacteria inoculums Seedlings in group TI and T3 grew significantly vigorously(P<0.05), of which, the plant height and stalk width of T3 seedlings was 1.26 and 1. 16 times greater than CK, respectively. T-RFLP data also showed that indexes of diversity and evenness in TI and T3 were subtly higher than those in CCK, reaching at 2. 12/2. 11 and 0.93/0.88. In the meantime, after analyzing the soil dominant group, we found the amount of soil pre dominant microorganisms in TI and T3 was 12 and 14, respectively, almost with no difference from the CKK data, but slightly higher than that in T2. Cylindrospermopsis and Kitasatospora can be only found in CK and TI and T3 with application of phosphorus bacteria inoculums. Different application methods showed positive impacts on stabi- zing the richness and diversity indexes of the soil microorganism populations. In conclusion, the application of phosphorus bacteria inoculums can improve the richness and diversity indexes of the soil microorganism 收稿日期:2016-09-10 基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-32)资助 共同第一作者简介:柯春亮,助教。E-mal: keeling@l63com戴嘉欣,本科生。E-mail:648985080@qq com 通信作者:张锡炎,研究员,博士生导师。E-mail: yanis81@163com

收稿日期: 2016-09-10 基金项目: 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-32)资助。 共同第一作者简介: 柯春亮，助教。E-mail：kecliang@163.com 戴嘉欣，本科生。E-mail：648985080@qq.com * 通信作者: 张锡炎，研究员，博士生导师。E-mail：zxyan1981@163.com 安徽农业大学学报, 2017, 44(3): 471-477 Journal of Anhui Agricultural University [DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20170524.006 网络出版时间：2017/5/24 11:17:00 [URL] http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20170524.1117.012.html 利用 T-RFLP 技术在施用解磷菌剂土壤中 微生物群落多样性分析 柯春亮 1 ，戴嘉欣 1 ，周登博 2 ，张锡炎 2* (1. 广东石油化工学院，茂名 525000；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101) 摘 要：为探讨解磷微生物菌肥对香蕉土壤根际微生态的影响，利用 T-RFLP （terminal restriction fragment length polymorphism）技术分析土壤均匀度指数、香农指数和优势种群等分析微生物多样性，研究高效解磷菌剂与化学磷 肥的不同组合施用方式对香蕉植株的生长情况和根际土壤微生物物量和群落结构的影响。结果显示，与对照 CK 相 比，T 处理组香蕉苗较 CK 组生长健壮，地上部分鲜重平均值为 42.2 cm，明显比 CK 高出 35.2%。接 M-3-01 解磷 细菌处理组 T1、T3 生长势最为显著（P＜0.05），其中，T3 株高和茎围分别是 CK 的 1.26、1.16 倍。T-RFLP 技术 分析微生物多样性表明， T1、T3 多样性指数和均匀度指数指标分别为 2.12/2.11 和 0.93/0.88，与 CCK 差异性不 明显，但略微高于 CK。同时，分析土壤优势种群，处理组 T1、T3 处理组土壤优势微生物种群数分别为 12 和 14， 数目基本与处理前土壤 CCK 的一致，而 T2 略低于 CK。拟柱孢藻（Cylindrospermopsis）和北里孢菌（Kitasatospora） 只存在于 CK 和施用解磷菌剂 T1、T3 处理土壤中。土壤种植香蕉苗后，不同施用方式对土壤微生物群落丰富度和 多样性的稳定具有积极影响。因此，施用高效解磷菌剂对维持土壤微生物群落丰富度和均匀度效果较好。 关键词：T-RFLP；解磷菌剂；土壤；微生物；多样性 中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2017)03047107 Microbial community diversity in the soil fertilized with phosphate solubilizing bacteria by terminal restriction fragment length polymorphism analysis KE Chunliang1 , DAI Jiaxin1 , ZHOU Dengbo2 , ZHANG Xiyan2 (1. Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101) Abstract: In order to study the impact of microbial fertilizer on banana soil rhizosphere’s micro-ecology, we used T-RFLP technology to analyze Evenness index E, Shannon-Weiner H index and dominant population. We ex￾tracted the total DNA from the soil to study the influences of different combinations of efficient phosphorus bacteria and chemical fertilizers on the growth of banana plants and rhizosphere soil microbial community quantity and structure. Compared with the control group, the banana seedling in T treatment groups was more robust with an av￾erage height of 42.2 cm, 35.2% higher than that of the control group, especially in T treatment groups with M3-01 phosphorus bacteria inoculums. Seedlings in group T1 and T3 grew significantly vigorously (P <0.05), of which, the plant height and stalk width of T3 seedlings was 1.26 and 1.16 times greater than CK, respectively. T-RFLP data also showed that indexes of diversity and evenness in T1 and T3 were subtly higher than those in CCK, reaching at 2.12/2.11 and 0.93/0.88. In the meantime, after analyzing the soil dominant group, we found the amount of soil pre￾dominant microorganisms in T1 and T3 was 12 and 14, respectively, almost with no difference from the CKK data, but slightly higher than that in T2. Cylindrospermopsis and Kitasatospora can be only found in CK and T1 and T3 with application of phosphorus bacteria inoculums. Different application methods showed positive impacts on stabi￾lizing the richness and diversity indexes of the soil microorganism populations. In conclusion, the application of phosphorus bacteria inoculums can improve the richness and diversity indexes of the soil microorganism

安徽农业大学学报 2017年 populations; but the mechanisms are yet to be explored Key words: T-RFLP; phosphate solubilizing bacteria; soil; microorganism; diversity 作为植物生长必需的肥料三要素之一,磷素以壤 多种的形式参与植物体内的生理生化代谢过程,对1.13主要培养基基础培养基:葡萄糖10g,硫 植物的生长代谢起着重要的作用,是农业生产的重酸铵05g,MgSO40.3g,NaCl0.3g,KCl03g, 要物质保障。全世界43%的农业土壤缺磷,中国MnSO4H2O003g,FeSO47HO003g,磷矿粉5 1.07×103hm2农田中大约有2/3严重缺磷。为满g,蒸馏水定容至1000mL,pH70~72 足当今农业生产的需要,在农业生产中大量施入可1.1.4PCR引物本研究所用引物均由上海生工生 溶性磷肥,造成了成本高、污染大以及使用时磷的物工程技术公司合成,引物信息见表1。 固定现象严重,破坏土壤结构,影响作物的产量与 品质等后果。目前,微生物菌肥作为改善土壤营养 表1PCR引物 状况和提高植物抗逆性的作用越来越受到重视。微 Table 1 primers for pCr 「物名称 序列 生物菌肥是由一种或数种有益微生物经发酵而成的 Primer name 无毒害绿色生物性肥料。土壤微生物多样性是衡量 Cuba27F[10615- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 土壤微生物群落结构稳定性的重要指标,反应了土 Eubac1492R[106]5- TACGGYTACCTTGTTACGACT-3 壤生态和土壤胁迫对微生物群落的影响。以目前 的条件,自然界中85%~99%微生物还难以培养,1.1.5供试土壤取自海口市龙华区(19°597.09N 而且将这有机群体脱离土壤这一特定环境进行培110°192497"E),为少砾质粘土,其理化性状为: 养,进行16sRNA基因的处理分析,无法准确地pH4.53,有机质含量0.51%,全氮(TN)0.0873% 反映原始群落结构和微生物多样性。 碱解氮(N)含量为535mgkg,有效磷(P2O3) T-RFLP技术是将RFLP技术和荧光标记技术相含量为32mgkg',速效钾(KO)含量为470 结合后发展的一种较先进的分子生态学方法,由 Liu mg.kg 等呵于1997年首次应用于微生物群落多样性的研1.2主要方法 究。有研究认为,该方法适于微生物群落多样性中 盆栽试验于2015年5-7月在中国热带农业科 等或更低环境样品的多样性分析。本研究目的通学院热带生物技术研究所温室进行,温室的条件控 过利用 T-RFLP技术,探究用高效解磷细菌制成的制为:温度为28℃左右,湿度为86%,自然光照 微生物菌肥直接施入土壤中对香蕉植株的生长情况试验设4个处理 和微生物群落结构的影响。 CK:无机磷基础培养基B(除磷矿粉) T1:M-3-01解磷菌剂 1材料与方法 T2:化学磷矿粉:T3:M-3-01解磷菌剂+化 11试验材料 学磷矿粉 1.11主要试剂本试验所用主要生化试剂有:土 本试验采用完全随机区组设计 壤基因组DNA快速提取试剂盒升级版(溶液型), 制备菌株M-3-01菌液:挑取代表细菌M3-01 海口越凡科技技术有限公司生产;DNA凝胶回收试少许接种到液体种子培养液中,转速设计 剂盒,康宁生命科学有限公司生产;MpI限制性150rmin1恒温摇床培育ld:无菌水稀释至活菌浓 内切酶,NEB公司生产;2× ag PCr MasterMi 度为10cfmL量级菌液备用。 博迈德生物公司生产;DL2000 DNA Marker 盆栽试验操作:提前一周,按照磷土质量 (MD14),天根生化科技有限公司生产;磷矿粉001gkg的比例将施磷处理的磷矿粉与土壤混匀 (柠檬酸浸提方法有效磷(P)含量为2.3gkg,后,备用。将处理好的香蕉杯苗移栽到营养钵中, l:1硝酸测定的全磷(P)为237.5gkg-),产地江每个处理15盆。解磷菌液需要1:50稀释比例浇灌 苏锦屏 移栽后第1天开始,按照试验设计浇灌相应的处理 1.1.2供试菌株本研究供试高效解磷矿粉菌株: 液,CK、T2同样施入等量灭菌无机磷培养基。每 虫内生沙雷氏菌M-3-01。分离于海口市临高县南宝次每株浇灌50mL,每隔5d浇灌1次。试验期间, 镇(19-471^N,109°5117"E)香蕉种植基地根系土施磷处理组补充一次磷矿粉,各处理的其他管理措

472 安 徽 农 业 大 学 学 报 2017 年 populations; but the mechanisms are yet to be explored. Key words: T-RFLP; phosphate solubilizing bacteria; soil; microorganism; diversity 作为植物生长必需的肥料三要素之一，磷素以 多种的形式参与植物体内的生理生化代谢过程，对 植物的生长代谢起着重要的作用，是农业生产的重 要物质保障[1]。全世界 43%的农业土壤缺磷，中国 1.07×108 hm2 农田中大约有 2/3 严重缺磷[2]。为满 足当今农业生产的需要，在农业生产中大量施入可 溶性磷肥，造成了成本高、污染大以及使用时磷的 固定现象严重，破坏土壤结构，影响作物的产量与 品质等后果。目前，微生物菌肥作为改善土壤营养 状况和提高植物抗逆性的作用越来越受到重视。微 生物菌肥是由一种或数种有益微生物经发酵而成的 无毒害绿色生物性肥料。土壤微生物多样性是衡量 土壤微生物群落结构稳定性的重要指标，反应了土 壤生态和土壤胁迫对微生物群落的影响[3]。以目前 的条件，自然界中 85%～99%微生物还难以培养[4]， 而且将这有机群体脱离土壤这一特定环境进行培 养，进行 16SrRNA 基因的处理分析，无法准确地 反映原始群落结构和微生物多样性[5]。 T-RFLP技术是将RFLP技术和荧光标记技术相 结合后发展的一种较先进的分子生态学方法，由Liu 等[6]于 1997 年首次应用于微生物群落多样性的研 究。有研究认为，该方法适于微生物群落多样性中 等或更低环境样品的多样性分析[7]。本研究目的通 过利用 T-RFLP 技术，探究用高效解磷细菌制成的 微生物菌肥直接施入土壤中对香蕉植株的生长情况 和微生物群落结构的影响。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 主要试剂 本试验所用主要生化试剂有：土 壤基因组 DNA 快速提取试剂盒升级版（溶液型）， 海口越凡科技技术有限公司生产；DNA 凝胶回收试 剂盒，康宁生命科学有限公司生产；Msp I 限制性 内切酶，NEB 公司生产；2×Taq PCR MasterMix， 博迈德生物公司生产； DL2000 DNA Marker （MD114），天根生化科技有限公司生产；磷矿粉 （柠檬酸浸提方法有效磷（P）含量为 2.3 g·kg-1， 1:1 硝酸测定的全磷（P）为 237.5 g·kg-1），产地江 苏锦屏。 1.1.2 供试菌株 本研究供试高效解磷矿粉菌株： 虫内生沙雷氏菌 M-3-01。分离于海口市临高县南宝 镇（19°47′1″N，109°51′17″E）香蕉种植基地根系土 壤。 1.1.3 主要培养基 基础培养基：葡萄糖 10 g，硫 酸铵 0.5 g，MgSO4 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g， MnSO4·H2O 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，磷矿粉 5 g，蒸馏水定容至 1 000 mL， pH7.0～7.2。 1.1.4 PCR 引物 本研究所用引物均由上海生工生 物工程技术公司合成，引物信息见表 1。 表 1 PCR 引物 Table 1 Primers for PCR 引物名称 Primer name 序列 Sequence Eubac27F[106] 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ Eubac1492R[106] 5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′ 1.1.5 供试土壤 取自海口市龙华区（19°59′7.09″N， 110°19′24.97″E），为少砾质粘土，其理化性状为： pH4.53，有机质含量 0.51%，全氮（TN）0.0873%， 碱解氮（N）含量为 53.5 mg·kg-1，有效磷（P2O5） 含量为 3.2 mg·kg-1，速效钾（K2O）含量为 47.0 mg·kg-1。 1.2 主要方法 盆栽试验于 2015 年 5—7 月在中国热带农业科 学院热带生物技术研究所温室进行，温室的条件控 制为：温度为 28℃左右，湿度为 86％，自然光照。 试验设 4 个处理： CK：无机磷基础培养基 B（除磷矿粉）； T1： M-3-01 解磷菌剂； T2： 化学磷矿粉；T3：M-3-01 解磷菌剂+化 学磷矿粉。 本试验采用完全随机区组设计。 制备菌株 M-3-01 菌液：挑取代表细菌 M-3-01 少许接种到液体种子培养液中，转速设计 150 r·min-1 恒温摇床培育 1 d；无菌水稀释至活菌浓 度为 109 cfμ·mL-1 量级菌液备用。 盆栽试验操作：提前一周，按照磷土质量 0.01 g·kg-1 的比例将施磷处理的磷矿粉与土壤混匀 后，备用。将处理好的香蕉杯苗移栽到营养钵中， 每个处理 15 盆。解磷菌液需要 1:50 稀释比例浇灌。 移栽后第 1 天开始，按照试验设计浇灌相应的处理 液，CK、T2 同样施入等量灭菌无机磷培养基。每 次每株浇灌 50 mL，每隔 5 d 浇灌 1 次。试验期间， 施磷处理组补充一次磷矿粉，各处理的其他管理措

4卷3期 柯春亮等:利用T-RFLP技术在施用解磷菌剂土壤中微生物群落多样性分析 施均一致。取香蕉苗试验处理60d后各处理香蕉苗的峰面积,N表示i所在图谱中有效峰的总面积S。 根际土壤样品,采用5点混样,为距离香蕉假茎其他数据统计分析利用SPSS190和 Microsoft excel 0.5m以内,深度为4~6cm。土壤样品采集后置于2010完成 无菌封口袋中,准确标记,冰盒密封4℃保存备用 根据图谱中OTU的数目以及相对峰面积值, 1.2.1香蕉植株生物量统计取试验60d的香蕉植通过以下公式计算多样性指数: 株,测量它们株高、茎围、植株地上、下部分鲜重 (1)香农指数( Shannon- Wiener index)H= 和干重。以上生物量数据均为平均值。测定数据3∑(m/n(n/=∑PnP 次重复,平均值作为试验结果。 (2)均匀度指数( Evenness index)E= HIH 1.2.2基于 T-RFLP方法土壤微生物群落多样性分析(其中,Ha=lnS)。 (1)土壤总DNA的提取。取5g土样,在放 于2mL的灭菌离心管中,用DNA提取试剂盒(土 2结果与分析 壤基因组DNA快速提取试剂盒升级版(溶液型))2.1解磷菌剂对香蕉植株生物量的影响 提取总DNA并纯化,经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。 如图1所示,不同处理组的香蕉苗生长状况均 (2)引物设计与细菌的16 SIdna的聚合酶链与对照表现出一定的差异性,香蕉苗生长情况为 反应( Polymerase chain reaction-PCR)扩增。处理3>处理1>处理2>CK。从表2可以看出, l6 SrNA引物:以27F、1492R双向引物进行PCR处理组香蕉苗较CK组生长健壮。T处理组中,接 扩增,27F5′端用FAM标记。 M-3-01解磷细菌处理组T1、T3的生长势最为显著 PCR反应体系:2×7 aq masterMix25山、10 CK表现出一定的植株矮小,叶片偏黄而狭小。处 umol-L- Forward primer 1 HL、10 umol-L-Reverse理T3是所有处理组效果最好的。平均株高为 primer1uL和模板1μL,补充 RNase-free至5052.84cm,平均茎围为65cm。分别是CK的126 L。PCR反应程序:94C预变性5min,94°C变和1.16倍。T处理组的植株生物量整体生长体现较 性05min,55°C退火05mim,72°C延伸1.5min,好的效果。不仅对植物地下部的生长有效果,对地 35个循环;72C延伸7mn,4℃C保存。其中,2×0g上部分也比较显著。T处理组地上部分鲜重平均值 PCR Master mix中含7 q DNA Polymerase 125U,为422cm,明显比CK高出352%。说明磷素可以 dNTP04 mmol- L-,Mg2+4 mmol- L。50uPCR促进植物生长,施加解磷菌剂的效果相对明显 产物用1%的TAE-琼脂糖凝胶进行电泳检测,并用 DNA纯化试剂盒纯化 (3)扩增产物限制性内切酶酶切反应。纯化后 的PCR产物用Mp酶进行单酶切,酶切反应体系 Msp II HL、10× NeB buffer 5、100×BSA37℃05 μ和模板10μ,补充 RNase-fre水至50uL。温 育4h后,65℃终止反应30min。吸取5山L酶切产 物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,剩余产物密封后用 图1接种解磷菌剂45d后香蕉苗生长情况 锡箔纸避光保藏,并送测 Figure 1 The growth situation of banana seedlings after inoculation of phosphate solubilizing for 45 days (4) T-RFLP图谱与数据统计分析。样品 T-RFLP结果用软件 Peak Scanner Software vI.0分2.2 T-RFLP分析解磷菌剂对土壤微生物多样性的 析,数据输出前需先设定片段阈值,末端限制性片 影响 段(TRFs)长度为50~500bp,(峰面积/总面积) 土壤微生物群落多样性一般用多样性指数表 %≥0.5%,荧光强度>50FU(荧光单位)的TRFs示,多样性指数是综合反映群落丰富度和均匀度的 视为有效峰,每个有效TRFs代表一个OTU,可作指标。 Shannon- Weiner指数和 Simpson指数包括了 群落丰富度分析,并通过网站(htp/rnp. limno-种的多寡和群落的异质性两方面. Shannon-Weiner ogy. wisc.edu/index. jsp)检索每个有效TRFs片段所指数反映土壤中微生物种群丰富度; Evenness index 代表的微生物类群。以有效TRFs片段的相对峰面指数则反映土壤微生物群落的均匀度。表3表示处 积(P1)作为对应OTU的相对丰度,相对峰面积可理前土壤和经不同处理60d后土壤微生物的TRFs 表示为:P1=nN×100%,式中n表示第i个TRFs有效片段(丰富度)数量、 Shannon- Weiner指数和

44 卷 3 期 柯春亮等: 利用 T-RFLP 技术在施用解磷菌剂土壤中微生物群落多样性分析 473 施均一致。取香蕉苗试验处理 60 d 后各处理香蕉苗 根际土壤样品，采用 5 点混样，为距离香蕉假茎 0.5 m 以内，深度为 4～6 cm。土壤样品采集后置于 无菌封口袋中，准确标记，冰盒密封 4℃保存备用。 1.2.1 香蕉植株生物量统计 取试验 60 d 的香蕉植 株，测量它们株高、茎围、植株地上、下部分鲜重 和干重。以上生物量数据均为平均值。测定数据 3 次重复，平均值作为试验结果。 1.2.2 基于 T-RFLP 方法土壤微生物群落多样性分析 （1）土壤总 DNA 的提取。取 5 g 土样，在放 于 2 mL 的灭菌离心管中，用 DNA 提取试剂盒（土 壤基因组 DNA 快速提取试剂盒升级版（溶液型）） 提取总 DNA 并纯化，经 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。 （2）引物设计与细菌的 16SrDNA 的聚合酶链 反应（ Polymerase chain reaction-PCR ）扩增。 16SrDNA 引物：以 27F、1492R 双向引物进行 PCR 扩增，27F 5′ 端用 FAM 标记。 PCR 反应体系：2×Taq MasterMix 25 μL、10 μmol·L-1 Forward primer 1 μL、10 μmol·L-1 Reverse primer 1 μL 和模板 1 μL，补充 RNase-free 水至 50 μL。PCR 反应程序：94 °C 预变性 5 min，94 °C 变 性 0.5 min，55 °C 退火 0.5 min，72 °C 延伸 1.5 min， 35 个循环；72 °C 延伸 7 min，4 °C 保存。其中，2×Taq PCR Master Mix 中含 Taq DNA Polymerase 1.25 U， dNTPs 0.4 mmol·L-1，Mg2+4 mmol·L-1。50 μL PCR 产物用 1%的 TAE-琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用 DNA 纯化试剂盒纯化。 （3）扩增产物限制性内切酶酶切反应。纯化后 的PCR产物用MspⅠ酶进行单酶切，酶切反应体系： Msp I 1 μL、10×NEB buffer 5 μL、100×BSA 37℃ 0.5 μL 和模板 10 μL，补充 RNase-free 水至 50 μL。温 育 4 h 后，65℃终止反应 30 min。吸取 5 μL 酶切产 物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物密封后用 锡箔纸避光保藏，并送测。 （4）T-RFLP 图谱与数据统计分析。样品 T-RFLP 结果用软件 Peak Scanner Software v1.0 分 析，数据输出前需先设定片段阈值，末端限制性片 段（T-RFs）长度为 50～500 bp，（峰面积/总面积） %≥0.5%，荧光强度＞50 FU（荧光单位）的 TRFs 视为有效峰，每个有效 TRFs 代表一个 OTU，可作 群落丰富度分析，并通过网站（http://trflp. limnol￾ogy.wisc.edu/index.jsp）检索每个有效 TRFs 片段所 代表的微生物类群。以有效 TRFs 片段的相对峰面 积（Pi）作为对应 OTU 的相对丰度，相对峰面积可 表示为：Pi =ni/N×100%，式中 ni 表示第 i 个 TRFs 的峰面积，N 表示 i 所在图谱中有效峰的总面积[8]。 其他数据统计分析利用 SPSS19.0 和 Microsoft Excel 2010 完成。 根据图谱中 OTU 的数目以及相对峰面积值， 通过以下公式计算多样性指数： （1）香农指数（Shannon-Wiener index）H= −∑(ni/N)ln(ni /N)=−∑Pi ln Pi。 （2）均匀度指数（Evenness index）E=H/Hmax （其中，Hmax=lnS）。 2 结果与分析 2.1 解磷菌剂对香蕉植株生物量的影响 如图 1 所示，不同处理组的香蕉苗生长状况均 与对照表现出一定的差异性，香蕉苗生长情况为： 处理 3＞处理 1＞处理 2＞CK。从表 2 可以看出，T 处理组香蕉苗较 CK 组生长健壮。T 处理组中，接 M-3-01 解磷细菌处理组 T1、T3 的生长势最为显著。 CK 表现出一定的植株矮小，叶片偏黄而狭小。处 理 T3 是所有处理组效果最好的。平均株高为 52.84 cm，平均茎围为 6.5 cm。分别是 CK 的 1.26 和 1.16 倍。T 处理组的植株生物量整体生长体现较 好的效果。不仅对植物地下部的生长有效果，对地 上部分也比较显著。T 处理组地上部分鲜重平均值 为 42.2 cm，明显比 CK 高出 35.2%。说明磷素可以 促进植物生长，施加解磷菌剂的效果相对明显。 图 1 接种解磷菌剂 45 d 后香蕉苗生长情况 Figure 1 The growth situation of banana seedlings after inoculation of phosphate solubilizing for 45 days 2.2 T-RFLP 分析解磷菌剂对土壤微生物多样性的 影响 土壤微生物群落多样性一般用多样性指数表 示，多样性指数是综合反映群落丰富度和均匀度的 指标。Shannon-Weiner 指数和 Simpson 指数包括了 种的多寡和群落的异质性两方面[9]。Shannon-Weiner 指数反映土壤中微生物种群丰富度；Evenness index 指数则反映土壤微生物群落的均匀度。表 3 表示处 理前土壤和经不同处理 60 d 后土壤微生物的 TRFs 有效片段（丰富度）数量、Shannon-Weiner 指数和

474 安徽农业大学学报 2017年 Evenness indeⅹ指数。研究结果表明,CK和ⅳ2土壤微生物群落丰度数低,各项多样性指标均低。说 壤微生物群落的TRFs片段数量同为8,多样性指数明在土壤种植香蕉苗后,各处理组对土壤微生物群 和均匀度指数指标为1.17/142和0.56/068均低于落丰富度和多样性的稳定具有积极影响。其中,使 CCK。而T1、T3处理多样性指数和均匀度指数指用高效解磷菌剂的处理T1和T3,TRFs片段数量 标分别为212/211和0.93/0.88,与CCK差异性不(10/1)、 Shannon- Weiner指数(2.12/2.11) 明显,但略微高于CK的0.56/1.17。说明高效解磷 Evenness index指数(093/0.88)较T2均提高 菌剂本身含有丰度的微生物,这对处理土壤微生物提高土壤微生物群落丰富度和均匀度稳定性较高, 群落丰富度、优势度和均匀度影响较大。从试验数而只施用无机磷处理T2的土壤差异不明显,对土 据分析,CK较其处理前的土壤或其他处理组的土壤微生物群落多样性影响最大。 表2不同处理对香蕉植株的生长影响 Table 2 Effects of different treatments on the growth of banana seedlings 鲜重 Fresh weight/g; plant 干重 Dry weight/ g plant 茎围/cm 地上部分 地下部分 地上部分 地下部分 Treatment Plant height Stem Shoot fresh Root fresh Root dry 42.07±4.0 56±0.88b 31.2±3.82 16.92.162 H386b 6.7±0.97 391±3.12b 18.5±1.132 3.05±005b 0.75±0.012 51.10±532 166±1.64b 3.03±0.12b 0.71±0.012 5282±5912 6.5±0.60 47.8±3.812 18.5±1662 4.26±0.102 0.76±0.012 注:表中不同的小写字母表示处理间差异显著(P<005);CK:基础培养基(除磷矿粉);T:M-3-01解磷菌剂; T2:化学磷矿粉;T3:M-3-01解磷菌剂+化学磷矿粉,下同 Note: Different letters meant significant difference at 0.05 level in the table; CK: Basic medium(except Phosphate rock) T1: M-3-01 phosphate solubilizing bacteria; T2: Phosphate rock; T3: M-3-01 phosphate solubilizing bacteria added with Phosphate rock. The same belo 表3不同处理后土壤微生物多样性变化 样品编号 丰富度指数S 多样性指数H 均匀度指数E Richness index Shannon-Weiner Evenness index 1.17 2.12 0.93 1.42 注:CCK为处理前原土壤。下同。Note: CCK show soil before treatment. The same below 23 T-RFLP图谱分析 壤优势TRFs片段为6段比较丰富 如图2所示,对于盆栽土壤的群落结构,处理 如图3所示,处理前CCK和空白对照土壤CK 前(CCK)原始土壤的优势TRFs片段有:54、55、的相对丰度分布在50~100bp和100~150bp2区 57、58和91bp;CK对照土壤中优势TRFs片段为间,其50~100bp的值分别为90.23%和90.2 54、56、57和90bp;T处理土壤中优势TRFs片较单一;T处理和CK处理土壤相对丰度较显著性 段有59、60和98bp;T2处理土壤中优势TRFs片差异,在T处理土壤中,它们相对分度片段区间分 段有60、61和98bp;T3菌群发酵液处理土壤中优布较广。其中50~100bp区间的相对丰度大小分别 势TRFs片段主要有56、6 1、96和112bp。为9531%、98.15%和82.5%;100~150bp区间的 从优势TRFs片段分布可以看出,CCK和CK处理相对丰度分别为340%、0%、和16.58%;T1、T2 土壤在54bp和57bp处有共同优势TRFs;Tl、T2在150~200bp区间的相对分度为128%、1.85% 和T3处理土壤共同优势TRFs片段为60bp;T1、≥200bp只有T3,相对丰度为092%;纵观分析结 2处理土壤共同优势TRFs片段为98bp;T2、T3果,T和T3处理土壤群落结构多样性优势种群丰 处理土壤共同优势TRFS片段为6lbp;T3处理土富,且种群分布面广

474 安 徽 农 业 大 学 学 报 2017 年 Evenness index 指数。研究结果表明，CK 和 T2 土 壤微生物群落的 TRFs 片段数量同为 8，多样性指数 和均匀度指数指标为 1.17/1.42 和 0.56/0.68 均低于 CCK。而 T1、T3 处理多样性指数和均匀度指数指 标分别为 2.12/2.11 和 0.93/0.88，与 CCK 差异性不 明显，但略微高于 CK 的 0.56/1.17。说明高效解磷 菌剂本身含有丰度的微生物，这对处理土壤微生物 群落丰富度、优势度和均匀度影响较大。从试验数 据分析，CK 较其处理前的土壤或其他处理组的土 壤微生物群落丰度数低，各项多样性指标均低。说 明在土壤种植香蕉苗后，各处理组对土壤微生物群 落丰富度和多样性的稳定具有积极影响。其中，使 用高效解磷菌剂的处理 T1 和 T3，TRFs 片段数量 （10/11）、Shannon-Weiner 指数（2.12/2.11）和 Evenness index 指数（0.93/0.88）较 T2 均提高，对 提高土壤微生物群落丰富度和均匀度稳定性较高， 而只施用无机磷处理 T2 的土壤差异不明显，对土 壤微生物群落多样性影响最大。 表 2 不同处理对香蕉植株的生长影响 Table 2 Effects of different treatments on the growth of banana seedlings 鲜重 Fresh weight /g·plant-1 干重 Dry weight /g·plant-1 处理 Treatment 株高/cm Plant height 茎围/cm Stem 地上部分 Shoot fresh weight 地下部分 Root fresh weight 地上部分 Shoot dry weight 地下部分 Root dry weight CK 42.07±4.07c 5.6±0.88b 31.2±3.82c 16.9±2.16a 2.76±0.06c 0.65±0.02b T1 46.10±3.86b 6.7±0.97a 39.1±3.12b 18.5±1.13a 3.05±0.05b 0.75±0.01a T2 51.10±5.32a 5.9±0.58b 39.7±1.77b 16.6±1.64b 3.03±0.12b 0.71±0.01a T3 52.82±5.91a 6.5±0.60a 47.8±3.81a 18.5±1.66a 4.26±0.10a 0.76±0.01a 注：表中不同的小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）；CK：基础培养基（除磷矿粉）；T1：M-3-01 解磷菌剂； T2：化学磷矿粉；T3：M-3-01 解磷菌剂+化学磷矿粉，下同。 Note: Different letters meant significant difference at 0.05 level in the table; CK: Basic medium (except Phosphate rock) T1:M-3-01phosphate solubilizing bacteria; T2: Phosphate rock; T3:M-3-01 phosphate solubilizing bacteria added with Phosphate rock.The same below. 表 3 不同处理后土壤微生物多样性变化 Table 3 Variation of soil microbial communities from different treatments 样品编号 No. 丰富度指数 S Richness index 多样性指数 H Shannon-Weiner 均匀度指数 E Evenness index CCK 9 2.01 0.92 CK 8 1.17 0.56 T1 10 2.12 0.93 T2 8 1.42 0.68 T3 11 2.11 0.88 注：CCK 为处理前原土壤。下同。Note: CCK show soil before treatment. The same below. 2.3 T-RFLP 图谱分析 如图 2 所示，对于盆栽土壤的群落结构，处理 前（CCK）原始土壤的优势 T-RFs 片段有：54、55、 57、58 和 91 bp；CK 对照土壤中优势 T-RFs 片段为 54、56、57 和 90 bp；T1 处理土壤中优势 T-RFs 片 段有 59、60 和 98 bp；T2 处理土壤中优势 T-RFs 片 段有 60、61 和 98 bp；T3 菌群发酵液处理土壤中优 势 T-RFs 片段主要有 56、60、58、61、96 和 112 bp。 从优势 T-RFs 片段分布可以看出，CCK 和 CK 处理 土壤在 54 bp 和 57 bp 处有共同优势 T-RFs；T1、T2 和 T3 处理土壤共同优势 T-RFs 片段为 60 bp；T1、 T2 处理土壤共同优势 T-RFs 片段为 98 bp；T2、T3 处理土壤共同优势 T-RFs 片段为 61 bp；T3 处理土 壤优势 T-RFs 片段为 6 段比较丰富。 如图 3 所示，处理前 CCK 和空白对照土壤 CK 的相对丰度分布在 50～100 bp 和 100～150 bp 2 区 间，其 50～100 bp 的值分别为 90.23%和 90.12%， 较单一； T 处理和 CK 处理土壤相对丰度较显著性 差异，在 T 处理土壤中，它们相对分度片段区间分 布较广。其中 50～100 bp 区间的相对丰度大小分别 为 95.31%、98.15%和 82.5%；100～150 bp 区间的 相对丰度分别为 3.40%、0%、和 16.58%；T1、T2 在 150～200 bp 区间的相对分度为 1.28%、1.85%， ≥200 bp 只有 T3，相对丰度为 0.92%；纵观分析结 果，T1 和 T3 处理土壤群落结构多样性优势种群丰 富，且种群分布面广

4卷3期 柯春亮等:利用T-RFLP技术在施用解磷菌剂土壤中微生物群落多样性分析 330 550 330 40000 CCK 20000 4000 10000 110220 550 2400 4800 330440 1000 图2不同处理土壤的 T-RFLP图谱 Figure 2 T-RFLP profile of soil with different treat CCK显著降低。CCK、CK和各处理土壤中,均存 口CCK 在优势种群食酸菌( acidovorax)、慢生根瘤菌 OCK ( Bradyrhizobium)、噬细胞菌( Cytophaga)和拟杆 OTI T2 菌( Bacteroides),说明此4种群是原土壤中的固有 菌属,且不受菌剂或化学磷肥影响能稳定存在的菌 属。而拟柱孢藻( Cylindrospermopsis)和北里孢菌 ■圈 ( Kitasatospora)优势种群只存在于在CK和施用 50-100 片段长度 bp Fragment length 解磷菌剂Tl、T3处理土壤中,而施用化学磷肥的 图3土壤样品酶切TRFs片段相对丰度 T2土壤却不存在。有研究表明,施加外源微生物菌 Figure 3 TRFs fragment length of the soil DNA after diges 剂可以改变植物根际土壤微生物类群。施用化学 磷矿粉或施用解磷菌剂在一定程度影响土壤某类菌 2.4土壤微生物优势种群比较 类生存,导致土壤微生物优势种群的变化。数据显 本试验是将MpI酶切后的TRFs片段,通过示,T处理组土壤优势微生物种群数量均高于CK 与网站(http://trflp.Limnology.wise.edu/index.jsp)数施加解磷菌剂的T1、T3处理组土壤优势微生物种 据库中的标准数进行比对,取各样品均取峰面积排群数分别为12和14,优势微生物种群数目基本与 最前3大TRFs片段比对出的相同菌属(重复率≥3处理前土壤CCK的一致。而12略低于CK。 次)视为该土壤样品的优势菌。不同处理土壤微生 综上所述,不同处理土壤都会具有其特有的优 物群落的优势种群分析结果(表4)显示,本试验势种群,对比发现,嗜气芽孢杆菌( Bacillus 样品共有19种优势微生物种群。不同土壤处理组之 hemophilus)和嗜线虫沙雷氏菌( Serratia nemata 间优势种群均有一定差异性,各处理组土壤与 Ck diphila)优势种群仅存在于施用高效解磷菌剂处理 土壤的优势种群均存在显著性差异。由表4中的数土壤中,说明该优势菌群是原解磷菌剂固有优势菌 据可知,CK处理组土壤优势微生物种群数量比群,对香蕉植株具有促生作用。处理前CCK土壤

44 卷 3 期 柯春亮等: 利用 T-RFLP 技术在施用解磷菌剂土壤中微生物群落多样性分析 475 图 2 不同处理土壤的 T-RFLP 图谱 Figure 2 T-RFLP profile of soil with different treatments 图 3 土壤样品酶切 TRFs 片段相对丰度 Figure 3 TRFs fragment length of the soil DNA after digestion 2.4 土壤微生物优势种群比较 本试验是将 MspⅠ酶切后的 TRFs 片段，通过 与网站（http://trflp.limnology. wise.edu/index.jsp）数 据库中的标准数进行比对，取各样品均取峰面积排 最前 3 大 TRFs 片段比对出的相同菌属（重复率≥3 次）视为该土壤样品的优势菌。不同处理土壤微生 物群落的优势种群分析结果（表 4）显示，本试验 样品共有 19 种优势微生物种群。不同土壤处理组之 间优势种群均有一定差异性，各处理组土壤与 CK 土壤的优势种群均存在显著性差异。由表 4 中的数 据可知，CK 处理组土壤优势微生物种群数量比 CCK 显著降低。CCK、CK 和各处理土壤中，均存 在优势种群食酸菌（Acidovorax）、慢生根瘤菌 （Bradyrhizobium）、噬细胞菌（Cytophaga）和拟杆 菌（Bacteroides），说明此 4 种群是原土壤中的固有 菌属，且不受菌剂或化学磷肥影响能稳定存在的菌 属。而拟柱孢藻（Cylindrospermopsis）和北里孢菌 （Kitasatospora）优势种群只存在于在 CK 和施用 解磷菌剂 T1、T3 处理土壤中，而施用化学磷肥的 T2 土壤却不存在。有研究表明，施加外源微生物菌 剂可以改变植物根际土壤微生物类群[10]。施用化学 磷矿粉或施用解磷菌剂在一定程度影响土壤某类菌 类生存，导致土壤微生物优势种群的变化。数据显 示，T 处理组土壤优势微生物种群数量均高于 CK。 施加解磷菌剂的 T1、T3 处理组土壤优势微生物种 群数分别为 12 和 14，优势微生物种群数目基本与 处理前土壤 CCK 的一致。而 T2 略低于 CK。 综上所述，不同处理土壤都会具有其特有的优 势种群，对比发现，嗜气芽孢杆菌（ Bacillus aerophilus）和嗜线虫沙雷氏菌（Serratia nemato￾diphila）优势种群仅存在于施用高效解磷菌剂处理 土壤中，说明该优势菌群是原解磷菌剂固有优势菌 群，对香蕉植株具有促生作用。处理前 CCK 土壤