中国农业大学自编教材 种子病理学实验指导 (植物保护专业和种子科学专业) 吴学宏李健强编 中国农业大学植物病理学系 2004年7月
中国农业大学自编教材 种子病理学实验指导 （植物保护专业和种子科学专业） 吴学宏 李健强编 中国农业大学植物病理学系 2004 年 7 月
目录 前言 .1 实验课须知 实验一普通光学显微镜使用、常见种传病害标本观察以及两种培养基制备.1 实验二西甜瓜种子带菌检测及杀菌剂消毒处理效果 10 实验三选择性培养基检测种子寄藏链格孢属真菌及药剂消毒处理效果12 实验四小麦种胚携带散黑穗病菌的检测. 13 实验五水稻种子中白叶枯病菌的噬菌体检测方法 .14 实验六水稻种传干尖线虫的Baemann漏斗检测方法.I5 实验七ELISA方法检测玉米种子带毒率 .16 实验八番茄病组织中细菌性溃疡病菌Cmm的分离和快速检测.17 实验九PCR方法检测白菜种传黑斑病菌.， .19
1 目 录 前 言.I 实验课须知. .II 实验一 普通光学显微镜使用、常见种传病害标本观察以及两种培养基制备. . 1 实验二 西/甜瓜种子带菌检测及杀菌剂消毒处理效果.10 实验三 选择 性培养 基检 测种子 寄藏链 格孢 属真菌 及药 剂消毒 处理效 果. . 1 2 实验四 小麦种胚携带散黑穗病菌的检测. . 1 3 实验五 水稻种子中白叶枯病菌的噬菌体检测方法 . .14 实验六 水稻种传干尖线虫的 Baemann 漏斗检测方法.15 实验七 ELISA 方法检测玉米种子带毒率. . .16 实验八 番茄病组织中细菌性溃疡病菌 C mm 的分离和快速检测. . 1 7 实验九 PCR 方法检测白菜种传黑斑病菌.19
实验一普通光学显微镜使用、常见种传病害标本观察以 及两种培养基(SNA及PDA)制备 普通光学显微镜是实验室中常用的进行植物病理学和其他生物研究的主要工具。它 可以用于观察微小的病原物以及植物发病后的微小变化。因此了解普通光学显微镜的构 造和使用对于进行植物病原菌和植物病害症状的观察是非常必要的。 微生物的生长发育需要一定的营养条件，在对植物病原菌进行人工培养时，也要根 据各种病原物的特点供给不同的营养。培养基的种类很多，主要根据研究目的和培养对 象的不同而确定培养基的成分。病原微生物的主要营养成分为碳源、氮源、矿物质和生 长素等。进行病原生物的分离培养，必须对所用的培养基和器皿进行灭菌，以尽量排除 其它微生物的干扰，保证工作的效果，因此要树立无菌的概念，掌握常用的灭菌方法。 一、实验目的 1、学习和掌握普通光学显微镜的使用与维护方法。 2、了解几种重要的种传病害的典型症状及病原的形态。认识植物病害的症状，了 解症状在病害诊断上的意义，加深对植物病害的感性认识。 3、学习和掌握马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)及选择性培养基(SNA)的制作、 灭菌方法。 二、实验材料和用具 1、各种植物病害的盒装标本及散装标本等。 2、病害挂图及主要植物病害的症状的幻灯片。 3、普通光学显微镜，放大镜、解剖刀，电炉，高压灭菌锅，天平，三角瓶，试管， 纱布，棉塞，防潮纸，锅，橡皮筋，玻棒，试管架等。 4、马铃薯，葡萄糖，琼脂，pH试纸，KHPO4,NaCO,MgSO47HO,葡萄糖， 天门冬酰胺（天冬素），蒸馏水等。 三、实验内容 1、普通光学显微镜使用和维护方法。 2、看幻灯片。 3、结合挂图，观察植物病害症状标本。注意发病部位，症状类型及发病部位上病 征的特点。 4、马铃薯葡萄糖琼胶培养基(PDA)及选择性培养基(SNA)的制作、灭菌。 四、实验步骤 1、SNA培养基的制备方法 将KHP041.36g,NaCO1.06g,MgS04705.0g,葡萄糖5.0g,天门冬酰胺（天 冬素)1.0g,琼脂20.0g称好后溶于1000ml蒸馏水，加热待其全部溶解后分装三角瓶中
2 实验一 普通光学显微镜使用、常见种传病害标本观察以 及两种培养基（SNA 及 PDA）制备 普通光学显微镜是实验室中常用的进行植物病理学和其他生物研究的主要工具。它 可以用于观察微小的病原物以及植物发病后的微小变化。因此了解普通光学显微镜的构 造和使用对于进行植物病原菌和植物病害症状的观察是非常必要的。 微生物的生长发育需要一定的营养条件，在对植物病原菌进行人工培养时，也要根 据各种病原物的特点供给不同的营养。培养基的种类很多，主要根据研究目的和培养对 象的不同而确定培养基的成分。病原微生物的主要营养成分为碳源、氮源、矿物质和生 长素等。进行病原生物的分离培养，必须对所用的培养基和器皿进行灭菌，以尽量排除 其它微生物的干扰，保证工作的效果，因此要树立无菌的概念，掌握常用的灭菌方法。 一、实验目的 1、学习和掌握普通光学显微镜的使用与维护方法。 2、了解几种重要的种传病害的典型症状及病原的形态。认识植物病害的症状，了 解症状在病害诊断上的意义，加深对植物病害的感性认识。 3、学习和掌握马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）及选择性培养基（SNA）的制作、 灭菌方法。 二、实验材料和用具 1、各种植物病害的盒装标本及散装标本等。 2、病害挂图及主要植物病害的症状的幻灯片。 3、普通光学显微镜，放大镜、解剖刀，电炉，高压灭菌锅，天平，三角瓶，试管， 纱布，棉塞，防潮纸，锅，橡皮筋，玻棒，试管架等。 4、马铃薯，葡萄糖，琼脂，pH 试纸，K2HPO4，NaCO3，MgSO4·7H2O，葡萄糖， 天门冬酰胺（天冬素），蒸馏水等。 三、实验内容 1、普通光学显微镜使用和维护方法。 2、看幻灯片。 3、结合挂图，观察植物病害症状标本。注意发病部位，症状类型及发病部位上病 征的特点。 4、马铃薯葡萄糖琼胶培养基（PDA）及选择性培养基（SNA）的制作、灭菌。 四、实验步骤 1、SNA 培养基的制备方法 将 K2HPO41.36g， NaCO31.06g，MgSO4·7H2O5.0g，葡萄糖 5.0g，天门冬酰胺（天 冬素）1.0g，琼脂 20.0g 称好后溶于 1000ml 蒸馏水，加热待其全部溶解后分装三角瓶中
进行灭菌。 2、PDA培养基的制备方法 称取去皮土豆200g,放入1000毫升水中煮沸30分钟，用纱布过滤，定容1000毫 升，加入葡萄糖17克，待其完全溶解后再加入琼脂17克，加热溶解。分装三角瓶进行 灭菌。 3、培养基的加压蒸气灭菌步骤 1)检查灭菌锅中的水量，一定要加到指定标度： 2)将欲灭闲的器物放入，加盖密封，对称旋紧盖上螺丝，打开气阀，开始加热： 3)水蒸气从气阀有力冲出时，要持续10分钟左右方可将空气排除尽，再关闭气门： 4)当压力上升到所需的指标后，开始计算灭菌时间，灭菌过程中保持压力不变： 5)达到灭菌时间后，停止加热，待其压力自动下降或者做开气阀慢慢放出蒸气使 压力下降，注意不可过急，但也不可太慢： 6)务使压力降到内外相等时，才能打开灭菌锅，取出灭菌器物。 灭菌过程中，排除尽灭菌锅内的空气是保证灭茵效果的关键，为了保证排气彻底， 在压力上升到5磅时，可再次打开气阀排气几分钟。 4注意 经过灭菌后的培养基和灭菌水从灭菌锅中取出放在橱内，要制备试管斜面的，放于 室温下稍冷却后再搁置成斜面，否则表面冷凝水太多，会影响微生物生长发育。 五、思考题 1、针对种传病害采用的最佳防治方法是什么？ 2、培养有些真菌时为什么采用选择性培养基？ 六、附录 一)普通光学显微镜一明视野显微镜使用简介 明视野显微镜是最常用的光学显微镜。其他光学显微镜都是由此发展而来的，基本结构与他相 同，只是在某些部分做一些改变。明视野显微镜的构造有机械装置和光学系统两部分。下面简单说 明将与使用有关的光学系统各部分的性能和显微镜的一般使用方法。 1、光学系统各部分的性能明视野显微镜有两组镜头，即物镜和目镜。物镜的作用是将标本放 大，在目镜的焦平面上形成真像，在经过目镜的放大而形成能见的实像。此外，明视野显微镜的光 学系统还有聚光镜、反光镜、光源等。 1)物镜：显微镜中最重要的部分是物镜，其他部分的作用是使物镜能够充分发挥其性能，得到 清晰的图像。 2)目镜：显微镜的物镜将微小物体造成一个放大的实像，但由于物体太细小，实像还不够大， 3
3 进行灭菌。 2、PDA 培养基的制备方法 称取去皮土豆 200g，放入 1000 毫升水中煮沸 30 分钟，用纱布过滤，定容 1000 毫 升，加入葡萄糖 17 克，待其完全溶解后再加入琼脂 17 克，加热溶解。分装三角瓶进行 灭菌。 3、培养基的加压蒸气灭菌步骤 1）检查灭菌锅中的水量，一定要加到指定标度； 2）将欲灭菌的器物放入，加盖密封，对称旋紧盖上螺丝，打开气阀，开始加热； 3）水蒸气从气阀有力冲出时，要持续 10 分钟左右方可将空气排除尽，再关闭气门； 4）当压力上升到所需的指标后，开始计算灭菌时间，灭菌过程中保持压力不变； 5）达到灭菌时间后，停止加热，待其压力自动下降或者做开气阀慢慢放出蒸气使 压力下降，注意不可过急，但也不可太慢： 6）务使压力降到内外相等时，才能打开灭菌锅，取出灭菌器物。 灭菌过程中，排除尽灭菌锅内的空气是保证灭菌效果的关键，为了保证排气彻底， 在压力上升到 5 磅时，可再次打开气阀排气几分钟。 4、注意 经过灭菌后的培养基和灭菌水从灭菌锅中取出放在橱内，要制备试管斜面的，放于 室温下稍冷却后再搁置成斜面，否则表面冷凝水太多，会影响微生物生长发育。 五、思考题 1、针对种传病害采用的最佳防治方法是什么？ 2、培养有些真菌时为什么采用选择性培养基？ 六、附录 一）普通光学显微镜—明视野显微镜使用简介 明视野显微镜是最常用的光学显微镜。其他光学显微镜都是由此发展而来的，基本结构与他相 同，只是在某些部分做一些改变。明视野显微镜的构造有机械装置和光学系统两部分。下面简单说 明将与使用有关的光学系统各部分的性能和显微镜的一般使用方法。 1、光学系统各部分的性能 明视野显微镜有两组镜头，即物镜和目镜。物镜的作用是将标本放 大，在目镜的焦平面上形成真像，在经过目镜的放大而形成能见的实像。此外，明视野显微镜的光 学系统还有聚光镜、反光镜、光源等。 1）物镜：显微镜中最重要的部分是物镜，其他部分的作用是使物镜能够充分发挥其性能，得到 清晰的图像。 2）目镜：显微镜的物镜将微小物体造成一个放大的实像，但由于物体太细小，实像还不够大
人眼在目视距离处仍看不清楚，同时人眼直接观看实像也不方便。需要在实像和眼睛之间再加一个 放大镜，将实像进一步放大，同时将它变成一个虚像才便于观看。这个所加的放大镜就是目镜。目 镜的功能除了二次放大外，还可将真像投影于银幕或照相，有的目镜还能校正物镜形成的色差。此 外目镜上还能安置测微尺和计数计等装置。 3)聚光镜和虹彩光圈：物镜下的聚光镜对提高物镜的分辨率是很重要的，简易显微镜没有聚光 镜，它得用凹面反光镜，形成一定角度的锥形光柱照射标本和物镜，一般只能形成64°左右的锥形 光柱。聚光镜由两个或多个透镜组成，它可以使光线从正面和斜面照射标本然后进入物镜，形成一 个大角度的锥形光柱。聚光镜下虹彩光圈的作用是调节聚光镜的数值口径，聚光镜的数值口径要和 所用物镜的数值口径配合，最好等于或稍微大于物镜的数值口径，使进入物镜光柱的角度大到能够 正好均匀照满物镜背面的透镜。 4)反光镜：反光镜是一个双面镜子，一面是平面，一面是凹面，起者接受外来光线并将光线送 到聚光镜或直接送到物镜上的作用。 5)光源：日光和灯光都可以作光源，以灯光较好，光色和强度都容易控制， 般的显微镜可用 普通的灯光。 2、明视野显微镜的使用方法 1)低倍镜镜检：先将低倍物镜的位置固定好，然后对准焦距。显微镜有自动止降”装置的，可 以先将物镜提高，然后向下调准焦点。许多显微镜是没有自动止降”装置的，最好是将物镜下降到 小于工作距离，用粗调逐渐提高，再用细调对准焦距。除去少数显微镜外，聚光镜的位置要放在最 高点，如视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下移，图像就可以消失。聚光镜的虹彩光 圈可适当调小一些，控制射入光线的量，以增加对比度。 2)高倍镜镜检：显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后转换到高倍镜基本上也对准 焦点，只要稍微转动微调即可。有些荷易的显微镜不是“共焦点”的，或者由于物镜的更换而不能达 到“共焦点”，就要采取上述将高倍物镜下移，然后向上调准焦点的方法。虹彩光圈要放大，不影响 物镜的数值口径，并使有足够的光，稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。 3)油浸镜镜检：油浸镜的工作距离很小，所以要防止玻片和物镜上透镜的损坏。一般是经低倍、 高倍到油浸镜，当高倍物镜对准焦点后，再加油用油浸镜检视。玻片标本也可以不经过低倍和高倍 物镜，直接用油浸镜镜检。显微镜有自动止降装置的，玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中， 到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点：没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的 侧面观察，将油浸镜下移到与玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。 使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油的流出。油浸镜所用的油要洁净。聚光镜要提高到最 高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，不然会降低数值口径而影响分辨率。在不影响对比度的情况下， 光线强一些为好，无论是油浸镜或高倍镜检视，都是用显微镜灯供给并调节光源
4 人眼在目视距离处仍看不清楚，同时人眼直接观看实像也不方便。需要在实像和眼睛之间再加一个 放大镜，将实像进一步放大，同时将它变成一个虚像才便于观看。这个所加的放大镜就是目镜。目 镜的功能除了二次放大外，还可将真像投影于银幕或照相，有的目镜还能校正物镜形成的色差。此 外目镜上还能安置测微尺和计数计等装置。 3）聚光镜和虹彩光圈：物镜下的聚光镜对提高物镜的分辨率是很重要的，简易显微镜没有聚光 镜，它得用凹面反光镜，形成一定角度的锥形光柱照射标本和物镜，一般只能形成 64º左右的锥形 光柱。聚光镜由两个或多个透镜组成，它可以使光线从正面和斜面照射标本然后进入物镜，形成一 个大角度的锥形光柱。聚光镜下虹彩光圈的作用是调节聚光镜的数值口径，聚光镜的数值口径要和 所用物镜的数值口径配合，最好等于或稍微大于物镜的数值口径，使进入物镜光柱的角度大到能够 正好均匀照满物镜背面的透镜。 4）反光镜：反光镜是一个双面镜子，一面是平面，一面是凹面，起着接受外来光线并将光线送 到聚光镜或直接送到物镜上的作用。 5）光源：日光和灯光都可以作光源，以灯光较好，光色和强度都容易控制，一般的显微镜可用 普通的灯光。 2、明视野显微镜的使用方法 1）低倍镜镜检：先将低倍物镜的位置固定好，然后对准焦距。显微镜有自动“止降”装置的，可 以先将物镜提高，然后向下调准焦点。许多显微镜是没有自动“止降”装置的，最好是将物镜下降到 小于工作距离，用粗调逐渐提高，再用细调对准焦距。除去少数显微镜外，聚光镜的位置要放在最 高点，如视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下移，图像就可以消失。聚光镜的虹彩光 圈可适当调小一些，控制射入光线的量，以增加对比度。 2）高倍镜镜检：显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后转换到高倍镜基本上也对准 焦点，只要稍微转动微调即可。有些简易的显微镜不是“共焦点”的，或者由于物镜的更换而不能达 到“共焦点”，就要采取上述将高倍物镜下移，然后向上调准焦点的方法。虹彩光圈要放大，不影响 物镜的数值口径，并使有足够的光，稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。 3）油浸镜镜检：油浸镜的工作距离很小，所以要防止玻片和物镜上透镜的损坏。一般是经低倍、 高倍到油浸镜，当高倍物镜对准焦点后，再加油用油浸镜检视。玻片标本也可以不经过低倍和高倍 物镜，直接用油浸镜镜检。显微镜有自动止降装置的，玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中， 到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点；没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的 侧面观察，将油浸镜下移到与玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。 使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油的流出。油浸镜所用的油要洁净。聚光镜要提高到最 高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，不然会降低数值口径而影响分辨率。在不影响对比度的情况下， 光线强一些为好，无论是油浸镜或高倍镜检视，都是用显微镜灯供给并调节光源