样品制备 。 分离制备成单细胞悬液，经200目的细胞筛过滤 (初浓度最后在1X107以上)，用PBS洗涤1~2次 ·加表面抗体：根据试剂说明对抗体进行预处理，根据 说明依次加入抗体（或将几种抗体制成预混液），按 说明时间进行孵育，洗1次 ·有胞内抗体的破膜，依试剂说明进行，洗1次，加入 抗体孵育，洗1次重悬，保证细胞悬液终浓度在1X106 以上 ·最后细胞浓度最好为2×106/ml,最少不能低于 5×105/ml ·上机检测
样品制备 • 分离制备成单细胞悬液，经200目的细胞筛过滤 （初浓度最后在1X107以上） ，用PBS洗涤1~2次 • 加表面抗体：根据试剂说明对抗体进行预处理，根据 说明依次加入抗体（或将几种抗体制成预混液），按 说明时间进行孵育，洗1次 • 有胞内抗体的破膜，依试剂说明进行，洗1次，加入 抗体孵育，洗1次重悬，保证细胞悬液终浓度在1X106 以上 • 最后细胞浓度最好为2×106/ml，最少不能低于 5×105/ml • 上机检测
样本准备中容易遇到的问题 1、细胞或组织不好消化和过消化 2、细胞终浓度不够 3、荧光染料的选择
1、细胞或组织不好消化和过消化 2、细胞终浓度不够 3、荧光染料的选择 样本准备中容易遇到的问题
·细胞或组织不好消化和过消化 ·酶的浓度 ·消化的时间 ·培养细胞消化特别要注意消化的时间最好 在1分钟内完成 ·不好消化的组织先剪碎，加入的酶溶液要 浸没组织块，发现溶液浑浊度较高时要将 酶溶液吸出，加新的酶溶液消化。消化过 程建议在37℃水浴中持续吹打
• 细胞或组织不好消化和过消化 • 酶的浓度 • 消化的时间 • 培养细胞消化特别要注意消化的时间最好 在1分钟内完成 • 不好消化的组织先剪碎，加入的酶溶液要 浸没组织块，发现溶液浑浊度较高时要将 酶溶液吸出，加新的酶溶液消化。消化过 程建议在37℃水浴中持续吹打
·细胞终浓度不够 ·增加初始细胞浓度，富集细胞 ·减少离心次数 ·离心力建议人细胞1200转/分钟左右(1000- 1500)小鼠细胞1500转/分钟左右 ·离心时间视具体情况确定
• 细胞终浓度不够 • 增加初始细胞浓度，富集细胞 • 减少离心次数 • 离心力建议人细胞1200转/分钟左右（1000- 1500）小鼠细胞1500转/分钟左右 • 离心时间视具体情况确定
免疫荧光染色 直接免疫荧光染色法 多用于对细胞表面标志的染色分析。选用单克 隆荧光抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标 志的单一抗体，一个抗体针对一个抗原。特异 性强，荥光标记干扰因素少，但需购买多种荧 光标记单抗。 间接免疫荧光染色法 选用特异性单抗（一抗)与待测细胞结合后， 再用荧光素标记的二抗（针对一抗的抗原特异 性的)，进行标记染色。适用于对一些新的未知 抗原的检测，不需要多种荧光抗体