站第二节显微镜和显微技术21 箱保藏使用更为普遍。例如，在各种基因工程手册中，一般都推荐在一70℃低温冰箱中保存菌株或细胞 的某些特殊生理状态（添加甘油做保护剂），例如，经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条 件下，也可利用-30-20℃的普通冰箱保存菌种，但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点就处在 这个温度范围内，常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结品，而对菌体造 成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意经常检查保藏物 的存活情况，贿时转种 3.干燥保藏法 水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术中 另一项经常采用的手段 沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的两项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生 物，如芽孢杆菌、放线菌等。 一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液， 加人无菌的沙土管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简 便易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。冷冻真 空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达 到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥，缺氧及低温的状 态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损 伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安甑管的保存、邮寄、使用均很 方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法，大多数专业的菌种保藏机 构均采用此法作为主要的微生物保存手段。 除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微 生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证 明对所有的微生物适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性，保藏物的使用特点及 现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进 行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 第二节显微镜和显微技术 绝大多数微生物的大小都远远低于肉眼的观察极限，因此，一般必须借助显微镜放大系统的作用才 能看到它们的个体形态和内部构造。除了放大外，决定显微观察效果的还有两个重要的因素，即分辨率 和反差。分辨率是指能辨别两点之间最小距离的能力，而反差是指样品区别于背景的程度，它们与显微 镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这 就是显微技术。而现代的显微技术，不仅仅是观察物体的形态、结构，而且发展到对物体的组成成分定 性和定量，特别是与计算机科学技术的结合出现的图像分析、模拟仿真等技术，为探素微生物的奥秘增 添了强大武器
22第二章微生物的纯培养和显微技术 一、显微镜的种类及原理 。1.普通光学显微镜 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们 由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜座、支架、载物台、调焦螺旋等部件，是显微镜的 基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统 由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种 可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。 能辨别两点之间最小距离的能力被称为分辨率。对任何显微镜来说，分辨率都是决定其观察效果 的最重要指标，也就是说显微镜所能达到的最小可分辨距离越小，这个显微镜的分辨率就越高。从物理 学角度看，光学显微镜的最小可分辨距离或分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为： 最小可分辨距离5 式中A为所用光源波长；8为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离（图2-7）：n为玻片 与物镜间介质的折射率，显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质，例如，空气(=1.0)、水 (n=1.33)、香柏油(n=1.52)等。nsin也被表示为数值孔径值(numerical aperture,NA),它是决定物 镜性能的最重要指标。光学显微镜在使用最短波长的可见光（入=450）作为光源时在油镜下可以达 到其最大分辨率0.184m(表2-1)。由于肉眼的正常分辨能力一般为0.25mm左右，因此光学显微镜 有效的最高放大倍数只能达到1000~1500倍，在此基础上进一步提高显微镜的放大能力对观察效果 的改善并无帮助。 工作距离 有 图2一7显微镜的数值孔径值与镜口角及工作距离间的关系 表2一1不同显微镜物镜的特性比较 特 物镜 搜索物镜 低倍镜 高倍镜 油镜 放大倍数 10X 40=45× 90-100× 数值孔径值 0.10 0.25 0.55-0.65 .25-1.4 焦深 40国 16 mm 4 mm 1.8-2.0mm 工作距离 17-20mm 4-8mm 0.5-0.7mm 0.1mm 蓝光(450m)时可以达到的分辨率 2.3m 0.9Lm 0.35μm 0.184m
第二节显微镜和显微技术23 2。暗视野显微镜 明视野显微镜的照明光线直接进入视野，属透射照明。生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明 的，不易看清。而暗视野显微镜则利用特殊的聚光器实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜， 而是由样品反射或折射后再进入物镜（图2一8），因此，整个视野是暗的，而样品是明亮的。正如我们在 白天看不到的星辰却可在黑暗的夜空中清楚地显现一样，在暗视野显微镜中由于样品与背景之间的反 差增大，可以清晰地观察到在明视野显微镜中不易看清的活菌体等透明的微小颗粒。而且，即使所观察 微粒的尺寸小于显微镜的分辨率，依然可以通过它们散射的光而发现其存在。因此，暗视野法主要用于 观察生活细菌的运动性。 聚光器 光侧 光 光级 a b 图2一8明视野(a)与暗视野(b)的照明示意图 3.相差显微镜 光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学 显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部 分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加 或减少，加快或落后的光被的相位会发生改变，产生相位差。人肉眼感觉不到光的相位差，但相差显微 镜配备有特殊的光学装置一环状光阑和相差板，利用光的干涉现象，能将光的相位差转变为人眼可以 察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。正由于样品的 这种反差是以不同部位的密度差别为基础形成的，因此，相差显微镜使人们能在不染色的情况下比较清 楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结 构，这是显微技术的一大突破.为此，其发明人F.Zeme获得了1953年的诺可尔整 4.荧光显微镜 有些化合物（荧光索）可以吸收紫外线并放出一部分光波较长的可见光，这种现象称为荧光。因 此，在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体，这就是荧光显微技术
24第二章微生物的纯培养和显微技术 的原理。由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记，它们 在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学 分子生物学中应用十分普遍。 5.透射电子显微镜 人们从本世纪初开始就尝试用波长更短的电磁波取代可见光来放大成像，以制造分辨本领更高的 显微镜。1933年，德国人E.Rska制成了世界上第一台以电子束作为“光源”的显微镜一电子显微 镜。其理论依据是：电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过玻璃 透镜时一样，产生偏转、汇聚或发散，并同样可以聚集成像。而一束电子具有被长很短的电磁波的性质 其波长与运动速度成反比，速度越快，波长越短。在理论上，电子波的波长最短可达到0.005m,所以 电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜（图2-9）。儿十年来，电子显微技术发展很快，应用也日 益广泛，对包括微生物学在内的许多学科的进步都起了巨大的推动作用。为了表彰E.Rusk及后来发 明扫描隧道显微镜的G.Binning和H.Rohrer在显微技术方面所做的开拓性工作，l986年他们3人共 同获得了当年的诺贝尔物理学奖 图2一9各种显微镜的分辨率范围 最早由E.Ruska等发明的电镜就是透射电子显微镜(transr microscope,TEM),其工 作原理和光学显微镜十分相似（图2-10）。但由于光源的不同，又决定了它与光学显微镜的一系列差
例第二节显微镜和显微技术25 异，主要表现在：①在电子的运行中如遇到游离的气体分子会因碰撞而发生偏转，导致物像散乱不清】 因此电镜镜筒中要求高真空；②电子是带电荷的粒子，因此电镜是用电磁圈来使“光线”汇聚、聚焦；③ 电子像人肉眼看不到，需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 。电子额 裹光 投影物镜 日镜 图2-10透射电子显微镜工作示意图(：)和照片(b) 6.扫描电子显微镜 扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)与光学显微镜和透射电镜不同，它的工作原理 类似于电视或电传真照片。电子枪发出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行 “扫描”，电子束扫到的地方就可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其他信号）。二次电子产生 的多少与电子束入射角度有关，也即是与样品表面的立体形貌有关。与此同时，在观察用的荧光屏上另 一个电子束也做同步的扫描。二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管 和放大器又变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。这样，样品上产生二次电子多的地方，在荧光 屏上相应的部位就越亮，我们就能得到一幅放大的样品立体图像。 扫描电镜主要被用于观察样品的表面结构。由于电子束孔径角极小，扫描电镜的景深很大，成像具 有很强的立体感。与扫描电镜相比，透射电镜景深较小，一般只能观察切成薄片后的二维图像。此外 在扫描电镜中，电子束的轰击使样品表面除放出二次电子外，还可产生许多有用的物理信号，如特征性 X线谱线、阴极荧光、背散射电子、俄歌电子及样品电流等。对这些信号分别进行收集、分析，还能得到