16第二章微生物的纯培养和显微技术 能很方便地通过平板分离法获得纯培养。 下面列出的是目前实验室用固体培养基获得微生物纯培养的儿种常用方法。 1.涂布平板法(spread plate method) 由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒 平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中头 常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌培养皿，制成无菌平板，冷 却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌涂布棒将菌液均匀分散至整个 平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4a)。 2.稀释倒平板法(pour plate method) 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1：10、1：100、1：1000,1：10000.），然后分别取 不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待 琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面 或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个微生物细胞繁殖形成的（图2 4b)。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 (a) 纪草装赞堂及 将特分离的材料逐级进行10信稀释。 (b) 甲爱要皮买套 图2-4稀释后用平板分离细菌单菌落 ()涂布平板法：()稀释倒平板法 3.平板划线法(streak plate method) 用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式 的连续划线（图2-5），微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜 的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 4.稀释摇管法(shake tube method) 用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采 用通常的方法制备平板，然后放置在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法 清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀
第一节微生物的分离和纯培养17 图2-5平板划线法 释倒平板法的一种变通形式·。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂熔化后冷却并保持 在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面似 倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。 进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡一石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管 壁之间，吹人无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌 落的移植。 三、用液体培养基获得纯培养 对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得 很好。然而并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如，一些个体大的细菌、许多原生动物和 藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。 通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度 稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么 有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例 提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。因此，采用液体培养基稀释法，同一个稀释度应有较多 的平行试管，而有可能获得纯培养的那个稀释度的大多数试管（一般应超过95%）应表现为没有细 菌生长。 四、单细胞（孢子）分离 稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微 生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体 进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成 反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。 对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较 也可采用其他方法来进行严格厌氧菌的分离、纯化，如Hg技术和厌氧手套箱技术，但对操作技术和实验设备都有较高的要求
第二章微生物的纯培养和显微技术 小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的徽生物，需采 用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显徽操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油 压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个徽生物细胞或孢子 以获得纯培养。在没有显徽操作仪时，也可采用一些变通的方法在显徽镜下进行单细胞分离，例如，将 经适当稀释后的样品制备成小液滴在显徽镜下观察，选取只含一个细胞的液滴进行培养以获得纯培养。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。 五、选择培养 没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培 养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其他被抑制。如果某种徽 生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然 界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占 少数。这种通过选择培养进行微生物钟培养分离的技术除为洗择培养分离，这种技术对于从自然果中 分离、寻找有用的微生物是十分重要的。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下生物群 落是由多种微生物组成的，因此，要从中分离出所需的特定徽生物是十分困难的，尤其当某一种徽生物 所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一毅的平板稀条方法几平不可能分离到该种撒生物 例如，若某处土壤中的微生物数量在10个/g时，必须稀释到10“才有可能在平板上分离到单菌落，而 如果所需微生物的数量仅为10~10'个/g:显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。 因此，要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用洗择培养分离的 方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群 落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。 1.选择平板培养 根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如，在从土壤中筛选蛋白 酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛 奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圆。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菊株进行 缔选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培 养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离：有些徽生物如螺旋体、黏细盥、蓝 细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己 和其他不能移动的徽生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取培养物 接种，如此反复操作，得到纯培养物。 2.富集培养 富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条 件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，使人们能够更容易地从自然界中分离到这种 所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的徽生物的特点从物理，化学，生物及综合多个方面进行 选择，如温度、H、紫外线、高压、光照、氧气、营养等方面。图2-6描述了采用富集方法从土壤中分离 能降解酚类化合物对羟基苯甲酸(p-hydroxybenryl acid)的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯 甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的士壤样品接种于该液体培养基中，培养 一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量徽生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培
第一节微生物的分离和纯培养19 养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基装甲酸的微生物的出例在培养物中将大大提高，将 培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟 基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培 养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为不生 长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数 的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。 修四 该格龙 薇整雀柔 的在的有底 中不能生 表现为生长 图2-6利用富集培养技术从土壤中分离能降解一羟基苯甲酸的微生物 富集培养是微生物学最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可满足 各种从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生 物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家 设计的能在特定环境中生长的微生物，尽管人们也许并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。 口名政·兴地·标索 二元培养物 分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是微不到的或是很难做到的。但 可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以 上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识地保持二 者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如，二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为 病毒是严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物 或具特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于 纯培养的培养方法 在自然环境中，精食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由 原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和黏菌，这些生物之间的关系可能 并不严格。有些也许能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困 很费事
■第二章微生物的纯培养和显微技术 六、微生物的保藏技术 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被 其他徽生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证徽生物研究和应用丁 作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项极为重要的徽生物学基础工作，微生物苗种是珍贵的自然资 源，具有重要意义，许多国家都设有相应的蘭种保藏机构（见第十五章），国际徽生物学联合会 (Intemational Union of Societie,IUMS)还专门设立了世界培养物保兼联盟(World Federation of Culture Collection,.WFGC),用计算机储存世界上各保藏机构提供的曹种数据资料，可以通 过国际互联网查询和索取，进行徽生物菌种的交流、研究和使用。 生物的生长一般都需要一定的水分、适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是标 据菌种特性及保藏目的的不同，给徽生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如，利用培养基 或宿主对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等， 令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的 可保戴几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保裁物恢复活力。 1.传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固 体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保戴微生物应注意针对不同的曹种而选择适宜的培养基，并在规 定的时问内进行移种，以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活，丧失徽生物菌种。在琼脂斜面 上保藏徽生物的时间因菌种的不同而有较大差异，有些可保存数年，而有些仅数周。 般来说，通过降 低培养物的代谢或防止培养基干燥，可延长传代保藏的保存时间。例如，在菌株生长良好后，改用橡皮 塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡，并放置低温保存；将一些菌的菌苔直接刮入燕馏水或其他缓冲 液后，密封置4℃保存，也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果，这种方法有时也被称为悬液 保藏法。 由于菌种进行长期传代十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使蘭 株的形态生理特性、代谢物的产量等发生变化，因此在一般情况下，在实验室里除了采用传代法对用 的菌种进行保存外，还必须根据条件采用其他方法，特别是对那些需要长期保存的曹种更是如此。 2.冷冻保藏 将徽生物处于冷冻状态，使其代谢作用停止，可达到保藏的目的。大多数徽生物都能通过冷冻进行 保存，细胞体积大的要比小的对低温更敏感，而无细胞壁的则比有细胞壁的敏感。其原因与低温会使细 胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时，适当采取速冻的方法，可因广 生的冰品小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温可减少对 细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如，0.5m0/L左右的甘油或二甲亚枫可 透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞：大分子物质如懒精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯叫 咯烷酮(PVP)虽不能透入细胞，但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜冻伤。因此，在采用冷冻 法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到-196℃。因 此，从适用的徽生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看，该方法在迄今使用的各种徽生物保藏方 法中是较理想的一种。但液氯保藏需使用专用器具，一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应，冰