根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题 1.制各细离染色标本时，尤其应该注意哪些环节 2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3.如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问避？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4.简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题 1. 制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3. 如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4. 简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
实验二细菌的革兰氏染色 一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性茵(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类， 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1,碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2.媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3.脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细南不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细南则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。 4.复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色：而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结品紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料 1.菌种：大肠杆菌(E.col)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2.染料：草酸铵结品紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3.其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇 擦镜纸等
实验二 细菌的革兰氏染色 一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理： 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G- ）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1. 碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2. 媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3. 脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是 95%的乙醇。 4. 复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料 1. 菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 染料：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇、 擦镜纸等
四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 +干燥固定 →草酸铵结品紫染色 约60秒 30秒 +水洗 →路哥氏碘液媒染一 →95%洒精脱色 +水洗 蕃红复染 +水洗 +干燥镜检 30-60秒 应注意，碘液媒染30秒钟后，直接用95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作，反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各南的形状、颜色） 六、思考题 1.什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过24小时？ 2.热固定的日的是什么？ 3什么大多数细菌染色用性染料而不用酸性染料进行染色？ 4.指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之
四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥固定 草酸铵结晶紫染色 水洗 路哥氏碘液媒染 95%酒精脱色 水洗 蕃红复染 水洗 干燥镜检 应注意，碘液媒染 30 秒钟后，直接用 95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作， 反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各菌的形状、颜色） 六、思考题 1. 什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过 24 小时？ 2. 热固定的目的是什么？ 3. 什么大多数细菌染色用碱性染料而不用酸性染料进行染色？ 4. 指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之。 约 60 秒 30-60 秒 约 30 秒
实验三 细菌的特殊染色 一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理： 芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子(endospore心)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易者色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不者色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，者色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其者色，而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 英膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料： 1.南种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis):营养琼脂斜面培养2Oh 肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides):肉汁等斜面培养20h 2.染料： (1)芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。 (2)荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无茵水 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuS04、95%乙醇、擦镜纸等
实验三 细菌的特殊染色 一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理： 芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料： 1. 菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：营养琼脂斜面培养 20h 肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）：肉汁等斜面培养 20h 2. 染料： （1）芽孢染色用 7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。 （2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等
四、实验方法与步骤： 芽孢染色： 1.孔雀绿染色法： 取一干净载片按无菌法取枯草芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂茵处 滴加7.6%的孔雀绿饱和水溶液，在微火上加热，染色10分钟后，用水冲洗，再用0.5% 蕃红花红液染色1分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。 2.石炭酸复红染色法： 在一支小试管(10*100mm)中，滴入3-4滴蒸溜水，用接种环取枯草芽孢杆菌于水 中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3-4滴)石炭酸复红 液摇匀。将此试管放入沸水浴中煮1015分钟，使芽孢及菌体者色。取此菌液2-3环在洁 净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色， 再用吕氏美蓝液复染12分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检 结果可见芽孢被染成红色，南体呈现蓝色。 荚膜染色法 1.方法①刚果红染色 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上：用接种环蘸取细菌培养液或 悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥：滴加1%HC1冲洗，使涂片呈蓝色：用 蒸馏水漂洗，除去HC1:,用美蓝复染1分钟，水洗，自然干燥后镜检。 镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色：无荚膜的菌，菌体蓝色，背 景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不者色环，但这不是英膜。 荚膜不着色的部分宽。 2.方法②湿墨汁法 ()制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 (2)加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸 收多余液。 (3)镜检。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3.方法③Anthony氏法 (1)涂片、固定：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 (2)染色：用1%结晶紫水溶液染色2分钟。 (3)脱色：用20%CuS04水溶液洗，再用毛边纸吸干。 (4)镜检并观察结果：荚膜淡紫色，细胞深紫色
四、实验方法与步骤： 芽孢染色： 1. 孔雀绿染色法： 取一干净载片按无菌法取枯草芽孢杆菌菌体少许制成涂片，风干固定后，在涂菌处 滴加 7.6%的孔雀绿饱和水溶液，在微火上加热，染色 10 分钟后，用水冲洗，再用 0.5% 蕃红花红液染色 1 分钟，水洗，风干后镜检。芽孢被染成绿色，营养体呈红色。 2. 石炭酸复红染色法： 在一支小试管（10*100mm）中，滴入 3-4 滴蒸溜水，用接种环取枯草芽孢杆菌于水 中，充分搅匀，使菌体分散，制成较浓的菌悬液。然后滴加等体积的(3-4 滴) 石炭酸复红 液摇匀。将此试管放入沸水浴中煮 10-15 分钟，使芽孢及菌体着色。取此菌液 2-3 环在洁 净的载片上做成涂片，自然干燥通过火焰固定后，在自来水下缓缓冲洗，使菌体脱色， 再用吕氏美蓝液复染 1-2 分钟。用水洗去多余染液，轻轻用吸水纸吸去水分，干后镜检， 结果可见芽孢被染成红色，菌体呈现蓝色。 荚膜染色法 1. 方法 ① 刚果红染色 将刚果红水溶液和明胶水溶液各一滴滴于干净载片上；用接种环蘸取细菌培养液或 悬浮液在载片上于上述两滴溶液混匀，自然干燥；滴加 1%HCl 冲洗，使涂片呈蓝色；用 蒸馏水漂洗，除去 HCl；，用美蓝复染 1 分钟，水洗，自然干燥后镜检。 镜检：有荚膜的菌，菌体蓝色，荚膜不着色，背景蓝紫色；无荚膜的菌，菌体蓝色，背 景蓝紫色。由于干燥菌体收缩，菌体四周也可能有一圈狭窄的不着色环，但这不是荚膜。 荚膜不着色的部分宽。 2. 方法 ② 湿墨汁法 （1）制菌液：加一滴墨汁于洁净的波片上，并挑少量菌与其充分混合。 （2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下 轻压，吸 收多余菌液。 （3） 镜检。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 3. 方法 ③ Anthony 氏法 （1） 涂片、固定：按常规法涂片，在空气中自然干燥。 （2） 染色：用 1％结晶紫水溶液染色 2 分钟。 （3） 脱色：用 20%CuSO4 水溶液洗，再用毛边纸吸干。 （4） 镜检并观察结果：荚膜淡紫色，细胞深紫色