（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色（图1-1)。固定的目的是：①杀死微生物，固定其细胞结构：②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉；③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。（4）染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色1分钟。（5）水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下，洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。（6）干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快干燥速度。（7）镜检。油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若使用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为正。有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼晴捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。（8）显微镜用毕后的处理：①上升镜筒，取下载玻片。②用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污溃或产生划痕，影响观察。③用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。④将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 （3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动 3~4 次，共约 3~4 秒。要求玻片温度不超过 60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图 1-1）。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构； ②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 （4）染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色 1 分钟。 （5）水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 （6）干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 （7）镜检。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 （8）显微镜用毕后的处理： ① 上升镜筒，取下载玻片。 ② 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，影响观察。 ③ 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 ④ 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告
根据观察结果，绘出细菌的形态图六、思考题1.制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？3.如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，有会怎样呢？4.简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
根据观察结果，绘出细菌的形态图 六、思考题 1. 制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？ 3. 如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长， 有会怎样呢？ 4. 简述油镜的使用方法，为什么使用油镜时要滴加香柏油？
实验二细菌的革兰氏染色一、目的要求掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。二、基本原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（Gt）和革兰氏阴性菌（G）两大类。革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用：1.碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。2.媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用的媒染剂是碘液。3.脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。4，复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色：而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰氏染色阳性反应。三、实验材料1.菌种：大肠杆菌（E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis）2.染料：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。3.其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇、擦镜纸等
实验二 细菌的革兰氏染色 一、目的要求 掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。 二、基本原理： 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Christain Gram 氏创立的，而后一些学者在此 基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，因为通过此法染色， 可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G- ）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液和作用： 1. 碱性染料：这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。 2. 媒染剂：其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。常用 的媒染剂是碘液。 3. 脱色剂：帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同， 而将细菌加以区分。革兰氏阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰氏阴性细菌则易被脱色。常 用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是 95%的乙醇。 4. 复染液：也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未 脱色菌进行比较。这里用的是蕃红花红溶液。 近年来由于对细菌细胞壁的结构有了较深入的了解，对革兰氏染色的机制提出不同的看 法。一般认为革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩 小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰氏阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂 肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻 止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。虽然如此，革兰氏染色的差异并不 能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，例如酵母菌细胞壁的成份完全和细菌 不同，但具有革兰氏染色阳性反应。 三、实验材料 1. 菌种：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 2. 染料：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、蕃红染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、95%乙醇、 擦镜纸等
四、实验方法与步骤操作过程如下：约60秒涂片草酸铵结晶紫染色★水洗★干燥固定约30秒★水洗路哥氏碘液媒染★95%酒精脱色蕃红复染水洗★干燥镜检+30-60秒应注意，碘液媒染30秒钟后，直接用95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中关键的一步。只有仔细操作，反复实践才能获得满意的实验结果。五、实验报告观察革兰氏染色反应的结果（说明各菌的形状、颜色）六、思考题1.什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过24小时？2.热固定的目的是什么？3.什么大多数细菌染色用碱性染料而不用酸性染料进行染色？4.指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之
四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥固定 草酸铵结晶紫染色 水洗 路哥氏碘液媒染 95%酒精脱色 水洗 蕃红复染 水洗 干燥镜检 应注意，碘液媒染 30 秒钟后，直接用 95%酒精从载玻片的一端冲洗脱色，直到留下的 酒精无明显的紫色为止。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染 色中关键的一步。只有仔细操作， 反复实践才能获得满意的实验结果。 五、实验报告 观察革兰氏染色反应的结果（说明各菌的形状、颜色） 六、思考题 1. 什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不超过 24 小时？ 2. 热固定的目的是什么？ 3. 什么大多数细菌染色用碱性染料而不用酸性染料进行染色？ 4. 指出革兰氏染色反应中关键步骤，并解释之。 约 60 秒 30-60 秒 约 30 秒
实验三乡细菌的特殊染色一、目的要求：学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。二、基本原理：芽孢染色：芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。由于芽胞壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或椭圆形的圈。为了使芽抱看色便于观察，可用芽抱染色法。芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。荚膜染色：荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察英膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把英膜衬托出来。由于英膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。三、实验材料：1.菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)：营养琼脂斜面培养20h肠膜状明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）：肉汁等斜面培养2Oh2.染料：（1）芽孢染色用7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。（2）荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲笨、无菌水、1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuS04、95%乙醇、擦镜纸等
实验三 细菌的特殊染色 一、目的要求： 学习掌握芽孢、荚膜染色的原理和方法。 二、基本原理： 芽孢染色： 芽孢又叫内生孢子（endospore），是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体， 通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊 是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。 由于芽胞壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行染色时，菌体和 芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，有的芽孢成淡红或淡蓝色的圆或 椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行 染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当 用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而 进入芽孢的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。 荚膜染色： 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质，其成份为多糖、糖蛋白或多肽。 由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以观察 荚膜通常采用负染色法，即将菌体染色后，再使背景着色，从而把荚膜衬托出来。由于荚膜 含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。 三、实验材料： 1. 菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)：营养琼脂斜面培养 20h 肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）：肉汁等斜面培养 20h 2. 染料： （1）芽孢染色用 7.6%饱和孔雀绿液、0.5%蕃红液（或石炭酸复红液和吕氏美蓝液）。 （2） 荚膜染色用刚果红、明胶水溶液，吕氏美蓝液等。 其它：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、 1%盐酸、电炉、墨汁、20%CuSO4、95%乙醇、擦镜纸等