构一般又统称为蛋白质的高级结构。关于蛋白质三维结构的研究,目前已经有 9000多种蛋白质的资料,蛋白质四级结构水平的概念已经不能满足科学发展的 需要。因此,蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构层次, 即超二级结构( Supersecondary Structure)和结构域( Structure domain) 超二级结构是指几种二级结构的组合物存在于各种结构中。结构域的概念是指蛋 白质分子中那些明显分开的球状部分。对于这两种新结构层次在本书中不作阐 1.一级结构 蛋白质的一级结构有时也称蛋白质的共价结构,一般而言,蛋白质的一级结 构是指构成蛋白质肽链的氨基酸残基的线性排列顺序,有时也称为残基的序列。 这一定义对只含氨基酸的简单蛋白质适用。但是在生物体内还有很多复合蛋白, 它们除包含氨基酸外,还有其他的组成。对复合蛋白,完整的一级结构概念应该 包括肽链以外的其他成分(例如糖蛋白上的糖链,脂蛋白中的脂质部分等)以及 这些非肽链部分的连接方式和位点。蛋白质的一级结构是一个无空间概念的一维 结构。 目前生物世界的蛋白质只有L型a-氨基酸才能构成,氨基酸残基之间通过 肽键连结(即一个氨基酸的a-氨基与另一个氨基的a-羧基结合失去一分子水, 形成肽键),由n个氨基酸构成的蛋白质含有(n-1)个肽键。蛋白质的末端氨基 酸与在肽链中的氨基酸不同,以游离的α-氨基酸存在的一端,称之为蛋白质的 N-端,习惯上列在左侧;另一端是以游离的α-羧基存在,则称为C-端,习惯上 在右侧。 NH--CH--COOH H2N--CH--COOH -NH--CH--CO--NH--CH--COOH +H2O 蛋白质的链长n(这里n是指蛋白质序列中的残基数)和序列,以及肽键的 顺反异构,它们决定蛋白质的物理化学性质、结构、生物活性与功能。氨基酸的 序列的作用如同形成二级和三级结构的密码(code),最终决定蛋白质的生物功 能。许多蛋白质的一级结构业已确定,已知的最短蛋白质链肠促胰链肽 ( secretin)和胰高血糖素( glucagon)含20~100个氨基酸残基,大多数蛋白 质都含有100~500个,某些不常见的蛋白质链多达几千个氨基酸残基。蛋白质 的分子质量范围从几千到1百万以上,例如存在肌肉中的肌联蛋白( Titin)的
构一般又统称为蛋白质的高级结构。关于蛋白质三维结构的研究，目前已经有 9000 多种蛋白质的资料，蛋白质四级结构水平的概念已经不能满足科学发展的 需要。因此，蛋白质化学家又在四级结构水平的基础上增加了两种新的结构层次， 即超二级结构（Supersecondary Structure）和结构域（Structure domain）。 超二级结构是指几种二级结构的组合物存在于各种结构中。结构域的概念是指蛋 白质分子中那些明显分开的球状部分。对于这两种新结构层次在本书中不作阐 述。 1.一级结构 蛋白质的一级结构有时也称蛋白质的共价结构，一般而言，蛋白质的一级结 构是指构成蛋白质肽链的氨基酸残基的线性排列顺序，有时也称为残基的序列。 这一定义对只含氨基酸的简单蛋白质适用。但是在生物体内还有很多复合蛋白， 它们除包含氨基酸外，还有其他的组成。对复合蛋白，完整的一级结构概念应该 包括肽链以外的其他成分（例如糖蛋白上的糖链，脂蛋白中的脂质部分等）以及 这些非肽链部分的连接方式和位点。蛋白质的一级结构是一个无空间概念的一维 结构。 目前生物世界的蛋白质只有 L 型 α-氨基酸才能构成，氨基酸残基之间通过 肽键连结（即一个氨基酸的 α-氨基与另一个氨基的 α-羧基结合失去一分子水， 形成肽键），由 n 个氨基酸构成的蛋白质含有（n-1）个肽键。蛋白质的末端氨基 酸与在肽链中的氨基酸不同，以游离的 α-氨基酸存在的一端，称之为蛋白质的 N-端，习惯上列在左侧；另一端是以游离的 α-羧基存在，则称为 C-端，习惯上 在右侧。 蛋白质的链长 n（这里 n 是指蛋白质序列中的残基数）和序列，以及肽键的 顺反异构，它们决定蛋白质的物理化学性质、结构、生物活性与功能。氨基酸的 序列的作用如同形成二级和三级结构的密码（code），最终决定蛋白质的生物功 能。许多蛋白质的一级结构业已确定，已知的最短蛋白质链肠促胰链肽 （secretin）和胰高血糖素（glacagon）含 20～100 个氨基酸残基，大多数蛋白 质都含有 100～500 个，某些不常见的蛋白质链多达几千个氨基酸残基。蛋白质 的分子质量范围从几千到 1 百万以上，例如存在肌肉中的肌联蛋白（Titin）的
分子质量超过100万,而肠促胰链肽的分子质量仅约为2300。大多数蛋白质的 分子质量在20000~10000之间 氨基酸残基 肽单位 co-NH+CH-COOH 在讨论蛋白质的一级结构时,多肽链的主链可用-NCC或CC-N-重复单元 描述,这里-NH-CHR-C0-(N-C-C-)相对于一个氨基酸残基,而-CHR-C0-NH (C-C-N-)是表示一个肽单位。两个氨基酸连接在一起的肽键是酰胺键(图5-2), 虽然是将它作为一个共价键来描述,但实际上肽键的C-N键具有40%的双键特性 而C=0键有40%左右的单键性质,这是由于电子的非定域作用结果导致产生的共 振稳定结构,使之肽键的CN键具有部分双键性质 24k 图5-2a--多肽链碎片的结构(反式构型)。原子间距离(A)和键角度(·),矩形 中的6个原子在同一平面上,中和ψ表示围绕一个a碳原子的可能扭转角,两个邻近a碳原 子的肽键各位于一个平面上,R1、R2和R处于反式位置(中=v=180°) 肽键的这个特性对蛋白质的结构具有重要的影响:其一,共振结构使-N在 p0~14之间不能被质子化:其二,肽键由于部分双键性质,C-N键不能够像 普通的CN单键那样可以自由旋转,CO-NH键的旋转角(即ω角)最大为6°。由 于这种限制的结果,肽键的每一个Ca-C0-NH-C。-片段(包含6个原子)处在同
分子质量超过 100 万，而肠促胰链肽的分子质量仅约为 2300。大多数蛋白质的 分子质量在 20000～100000 之间。 在讨论蛋白质的一级结构时，多肽链的主链可用-N-C-C-或-C-C-N-重复单元 描述，这里-NH-CHR-CO-（-N-C-C-）相对于一个氨基酸残基，而-CHR-CO-NH- （-C-C-N-）是表示一个肽单位。两个氨基酸连接在一起的肽键是酰胺键（图5-2）， 虽然是将它作为一个共价键来描述，但实际上肽键的 C-N 键具有 40%的双键特性， 而 C=0 键有 40%左右的单键性质，这是由于电子的非定域作用结果导致产生的共 振稳定结构，使之肽键的 C-N 键具有部分双键性质。 图 5-2 α-L-多肽链碎片的结构（反式构型）。原子间距离（Å）和键角度（˙），矩形 中的 6 个原子在同一平面上，φ和ψ表示围绕一个α碳原子的可能扭转角，两个邻近α碳原 子的肽键各位于一个平面上，R1、R2和R3处于反式位置（φ=ψ=180。 ） 肽键的这个特性对蛋白质的结构具有重要的影响：其一，共振结构使-NH在 pH 0～14 之间不能被质子化；其二，肽键由于部分双键性质，-C-N键不能够像 普通的C-N单键那样可以自由旋转，CO-NH键的旋转角（即ω角）最大为 6°。由 于这种限制的结果，肽键的每一个-Cα-CO-NH-Cα-片段（包含 6 个原子）处在同
个平面上,称之为肽平面,于是,多肽主链可描述为通过C原子连接的一系列 Ca-CO-NH-C-平面(图5-2)。多肽主链的C=0和N-H基之间在适宜的条件下是可 以形成氢键的。因为肽键在多肽主链中约占共价键总数的1/3,它们限制了多肽 主链的转动自由度,从而显著减少了主链的柔顺性。从已知结构的蛋白质分析表 明,尽管多数肽平面是不可扭曲的平面,但也有一些肽平面是可扭曲的。也就是 说,肽链的C-N链虽然带有双键的性质,不易旋转,但也不是绝对刚性的,可在 定范围内旋转,NCa和C-C键具有旋转自由度,它们的两面角分别为φ和v 其三,电子的非定域作用使羰基的氧原子带有部分负电荷,NH基的氢原子带有 部分的正电荷。由于上述原因,因此,多肽主链上的C=0和NH基之间可以在主 链内或主链与主链之间形成氢键。 既然肽键具有部分双键特征,因此肽键上的取代基也就可能出现类似于烯烃 那样的顺反异构体 Ca i+l 反式( trans) 顺式(cis) 然而,蛋白质中的肽键和多数顺反异构体一样,顺式因大基团间的相互作用 而处于高能态,是不稳定的;反式则因处于较低能态,在热力学上是较稳定的。 因此,蛋白质中几乎所有的肽键都是以反式构型存在,顺式和反式的比例为1 1000,反式向顺式转变时肽键的自由能增加34.8kJ/mol,实际上在蛋白质中肽 键的异构化作用是不存在的。但是在含有脯氨酸残基的肽键是例外,存在顺式构 型。因为脯氨酸残基参与的肽键,反式向顺式转变的自由能仅约为7.8kJ/mol, 在高温下这些键有时能发生反式向顺式转变的异构化作用,顺式和反式出现的几 率之比为2:8。虽然NCa和Ca-C键确实是单键,理论上φ和ψ应具有360°转动 自由度,实际上它们的转动自由度由于Ca上侧链原子的空间位阻效应而受到限 制,这些限制使多肽链的柔顺性进一步降低
一个平面上，称之为肽平面，于是，多肽主链可描述为通过Cα原子连接的一系列 -Cα-CO-NH-Cα-平面（图 5-2）。多肽主链的C=0 和N-H基之间在适宜的条件下是可 以形成氢键的。因为肽键在多肽主链中约占共价键总数的 1/3，它们限制了多肽 主链的转动自由度，从而显著减少了主链的柔顺性。从已知结构的蛋白质分析表 明，尽管多数肽平面是不可扭曲的平面，但也有一些肽平面是可扭曲的。也就是 说，肽链的C-N链虽然带有双键的性质，不易旋转，但也不是绝对刚性的，可在 一定范围内旋转，N-Cα和Cα-C键具有旋转自由度，它们的两面角分别为φ和ψ ； 其三，电子的非定域作用使羰基的氧原子带有部分负电荷，N-H基的氢原子带有 部分的正电荷。由于上述原因，因此，多肽主链上的C=0 和N-H基之间可以在主 链内或主链与主链之间形成氢键。 既然肽键具有部分双键特征，因此肽键上的取代基也就可能出现类似于烯烃 那样的顺反异构体。 然而，蛋白质中的肽键和多数顺反异构体一样，顺式因大基团间的相互作用， 而处于高能态，是不稳定的；反式则因处于较低能态，在热力学上是较稳定的。 因此，蛋白质中几乎所有的肽键都是以反式构型存在，顺式和反式的比例为 1： 1000，反式向顺式转变时肽键的自由能增加 34.8kJ/mol，实际上在蛋白质中肽 键的异构化作用是不存在的。但是在含有脯氨酸残基的肽键是例外，存在顺式构 型。因为脯氨酸残基参与的肽键,反式向顺式转变的自由能仅约为 7.8kJ/mol， 在高温下这些键有时能发生反式向顺式转变的异构化作用，顺式和反式出现的几 率之比为 2：8。虽然N-Cα和Cα-C键确实是单键，理论上φ和ψ应具有 360°转动 自由度，实际上它们的转动自由度由于Cα上侧链原子的空间位阻效应而受到限 制，这些限制使多肽链的柔顺性进一步降低
图5-3多肽主链的肽单位中原子的平面构型 φ和是C。~N和Ca键的双面(扭转)角,侧链位于平面上方或下方 2.二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链骨架部分氨基酸残基有规则的周期性空间排 列,即肽链中局部肽段骨架形成的构象。它们是完整肽链构象(三级结构)的结 构单元,是蛋白质复杂的空间构象的基础,故它们也可称为构象单元。它不包括 侧链的构象和整个肽链的空间排列。在多肽链某一片段中,当依次相继的氨基酸 残基具有相同的φ和ν转扭角时,就会出现周期性结构。氨基酸残基之间近邻 或短程的非共价相互作用,将决定两面角φ和ψ的扭转,同时导致局部自由能 的降低。在多肽链的某些片段区域,当依次连接的氨基酸残基的成对φ和ψ二 面角取不同值时,这些区域则为非周期或无规结构 般说来,在蛋白质分子中主要存在两种周期性(有规则)的二级结构,它 们是螺旋结构和伸展的折叠结构。 各类二级结构的形成几乎全是由于肽链骨架中的羰基上的氧原子和亚胺基 上的氢原子之间的氢键所维系。其他的作用力,例如范德华力等,也有一定的贡 献。某一肽段,或某些肽段间的氢键越多,它(们)形成的二级结构就越稳定, 即二级结构的形成是一种协同的趋势。 (1)螺旋结构 在蛋白质二级结构中通常将螺旋看成是蛋白质复杂构象的基础,蛋白质的螺 旋结构是由于依次相继的氨基酸残基的成对二面角φ和W角,分别按同一组值扭 转而形成的周期性规则构象。理论上φ和ψ角可以选择不同的组合值,那么,蛋 白质就可能产生几种不同几何形状的螺旋结构。然而,蛋白质实际上仅有α-螺 旋,3。-螺旋和π-螺旋三种形式的螺旋结构(图5-4),其中α-螺旋(α- helix) 是蛋白质中最常见的规则二级结构,也是最稳定的构象。 α-螺旋每圈螺旋包含3.6个氨基酸残基,螺距(每圈所占的轴长)为
图 5-3 多肽主链的肽单位中原子的平面构型 φ和ψ是Cα-N和Cα-C键的双面(扭转) 角,侧链位于平面上方或下方 2. 二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链骨架部分氨基酸残基有规则的周期性空间排 列，即肽链中局部肽段骨架形成的构象。它们是完整肽链构象（三级结构）的结 构单元，是蛋白质复杂的空间构象的基础，故它们也可称为构象单元。它不包括 侧链的构象和整个肽链的空间排列。在多肽链某一片段中，当依次相继的氨基酸 残基具有相同的φ和ψ 转扭角时，就会出现周期性结构。氨基酸残基之间近邻 或短程的非共价相互作用，将决定两面角φ和ψ 的扭转，同时导致局部自由能 的降低。在多肽链的某些片段区域，当依次连接的氨基酸残基的成对φ和ψ二 面角取不同值时，这些区域则为非周期或无规结构。 一般说来，在蛋白质分子中主要存在两种周期性（有规则）的二级结构，它 们是螺旋结构和伸展的折叠结构。 各类二级结构的形成几乎全是由于肽链骨架中的羰基上的氧原子和亚胺基 上的氢原子之间的氢键所维系。其他的作用力，例如范德华力等，也有一定的贡 献。某一肽段，或某些肽段间的氢键越多，它（们）形成的二级结构就越稳定， 即二级结构的形成是一种协同的趋势。 （1）螺旋结构 在蛋白质二级结构中通常将螺旋看成是蛋白质复杂构象的基础，蛋白质的螺 旋结构是由于依次相继的氨基酸残基的成对二面角φ和ψ角，分别按同一组值扭 转而形成的周期性规则构象。理论上φ和ψ角可以选择不同的组合值，那么，蛋 白质就可能产生几种不同几何形状的螺旋结构。然而，蛋白质实际上仅有α-螺 旋，310-螺旋和π-螺旋三种形式的螺旋结构（图 5-4），其中α-螺旋（α-helix） 是蛋白质中最常见的规则二级结构，也是最稳定的构象。 α-螺旋每圈螺旋包含 3.6 个氨基酸残基，螺距（每圈所占的轴长）为
0.54πm,每一个氨基酸残基的垂直距离,即每圈螺旋沿螺旋轴上升0.15m。每 个残基绕轴旋转100°(即360°/3.6),螺旋中氨基酸侧链在垂直于螺旋轴的方 向取向(图5-4)。在α-螺旋中,所有的肽单位都是刚性平面结构,其构象符合 立体化学的稳定原则,氢键使α-螺旋稳定,NH基的氢和位于螺旋下一圈的肽键 的氧(即前面第四个残基的C=0)之间形成许多氢键。由于氢键的形成和所形成 的电偶极指向相同的方向,所以螺旋结构有很高的稳定性。在α-螺旋的氢键封 闭环内即每对氢键包含13个主链原子,因此,α-螺旋有时又称3.63螺旋。氢 键的方向与轴平行,从而N、H和0几乎都在一条直线上,氢键的长度,即N-H…0 的距离约为0.29m,键的强度约为18.8kJ/mol。α-螺旋能以右手和左手螺旋两 种形式存在,然而右手螺旋更稳定,对于L-氨基酸构成的左手螺旋,由于侧链和 肽链骨架过于靠近,其能量较高,构象不稳定,故而很罕见。天然蛋白质中的α 一螺旋几乎都是右手α-螺旋。 3螺旋是一种二级结构,为非典型的α-螺旋构象,形成氢键的N、H、0三原 子不在一直线上,有时存在于球蛋白的某些部位,它是每圈包含三个氨基酸残基 的α-螺旋,每对氢键包含10个原子。最近的研究结果认为,310螺旋可能是一种 热力学的中间产物,比典型的α-螺旋更紧密。此外还有某些不常见的螺旋,像 π和γ螺旋每圈分别有4.4和5.2个氨基酸残基,它们不如α-螺旋稳定,π 螺旋则更松散,这些螺旋仅存在于包含少数氨基酸的短片段中,而且它们对大多 数蛋白质的结构不重要。脯氨酸是亚氨基酸,在肽链中其残基的丙基侧链与氨基 通过共价键可形成的吡咯环结构,N-C键不能旋转,因此,φ角具有一个固定体 值70°。此外,氮原子上不存在氢,也不可能形成氢键。由于上述两个原因 含有脯氨基残基的片段部分不可能形成α-螺旋。事实上,脯氨酸可以看作是 螺旋的中断剂。含有髙水平脯氨酸残基的蛋白质趋向于无规或非周期结构。例如 β-酪蛋白和αs1-酪蛋白中的脯氨基残基分别占总氨基酸残基的17%和8.5%, 而且它们均匀地分布在整个蛋白质的一级结构中。因此,这两种蛋白质不存在a 螺旋结构,而是呈无规卷曲结构。然而,聚脯氨酸能够形成两种螺旋结构,命名 为聚脯氨酸I(PPⅠ)和聚脯氨酸Ⅱ(PⅡ)。聚脯氨酸I为左手螺旋,每圈螺旋 沿螺旋轴上升0.19π,每圈螺旋仅含3.3个氨基酸残基,顺式肽键构型;聚脯 氨酸Ⅱ也是左手螺旋,肽键呈反式构型,两个残基之间的距离在轴上投影为 0.3lmm,每圈螺旋仅含3个残基。这两种结构能够相互转变,在水溶液介质中聚 脯氨酸Ⅱ更稳定,存在于胶原蛋白中。一条多肽链能否形成α-螺旋,以及形成 的螺旋是否稳定,与它的氨基酸组成和排列顺序有极大的关系,某些氨基酸侧链 的同种电荷静电排斥效应或立体位阻使得多肽链不能建立α-螺旋结构
0.54nm，每一个氨基酸残基的垂直距离，即每圈螺旋沿螺旋轴上升 0.15nm。每 个残基绕轴旋转 100°（即 360°/3.6），螺旋中氨基酸侧链在垂直于螺旋轴的方 向取向（图 5-4）。在α-螺旋中，所有的肽单位都是刚性平面结构，其构象符合 立体化学的稳定原则，氢键使α-螺旋稳定，N-H基的氢和位于螺旋下一圈的肽键 的氧（即前面第四个残基的C=O）之间形成许多氢键。由于氢键的形成和所形成 的电偶极指向相同的方向，所以螺旋结构有很高的稳定性。在α-螺旋的氢键封 闭环内即每对氢键包含 13 个主链原子，因此，α-螺旋有时又称 3.613螺旋。氢 键的方向与轴平行，从而N、H和O几乎都在一条直线上，氢键的长度，即N-H…O 的距离约为 0.29nm，键的强度约为 18.8kJ/mol。α-螺旋能以右手和左手螺旋两 种形式存在，然而右手螺旋更稳定，对于L-氨基酸构成的左手螺旋，由于侧链和 肽链骨架过于靠近，其能量较高，构象不稳定，故而很罕见。天然蛋白质中的α －螺旋几乎都是右手α-螺旋。 310螺旋是一种二级结构，为非典型的α-螺旋构象，形成氢键的N、H、O三原 子不在一直线上，有时存在于球蛋白的某些部位，它是每圈包含三个氨基酸残基 的α-螺旋，每对氢键包含 10 个原子。最近的研究结果认为，310螺旋可能是一种 热力学的中间产物，比典型的α-螺旋更紧密。此外还有某些不常见的螺旋，像 π和γ螺旋每圈分别有 4.4 和 5.2 个氨基酸残基，它们不如α-螺旋稳定，π- 螺旋则更松散，这些螺旋仅存在于包含少数氨基酸的短片段中，而且它们对大多 数蛋白质的结构不重要。脯氨酸是亚氨基酸，在肽链中其残基的丙基侧链与氨基 通过共价键可形成的吡咯环结构，N-Cα键不能旋转，因此，φ角具有一个固定体 值 70°。此外，氮原子上不存在氢，也不可能形成氢键。由于上述两个原因， 含有脯氨基残基的片段部分不可能形成α-螺旋。事实上，脯氨酸可以看作是α- 螺旋的中断剂。含有高水平脯氨酸残基的蛋白质趋向于无规或非周期结构。例如 β-酪蛋白和αs1 -酪蛋白中的脯氨基残基分别占总氨基酸残基的 17%和 8.5%， 而且它们均匀地分布在整个蛋白质的一级结构中。因此，这两种蛋白质不存在α- 螺旋结构，而是呈无规卷曲结构。然而，聚脯氨酸能够形成两种螺旋结构，命名 为聚脯氨酸I（PPⅠ）和聚脯氨酸Ⅱ（PPⅡ）。聚脯氨酸I为左手螺旋，每圈螺旋 沿螺旋轴上升 0.19nm，每圈螺旋仅含 3.3 个氨基酸残基，顺式肽键构型；聚脯 氨酸Ⅱ也是左手螺旋，肽键呈反式构型，两个残基之间的距离在轴上投影为 0.31nm，每圈螺旋仅含 3 个残基。这两种结构能够相互转变，在水溶液介质中聚 脯氨酸Ⅱ更稳定，存在于胶原蛋白中。一条多肽链能否形成α-螺旋，以及形成 的螺旋是否稳定，与它的氨基酸组成和排列顺序有极大的关系，某些氨基酸侧链 的同种电荷静电排斥效应或立体位阻使得多肽链不能建立α-螺旋结构