巴楚医学2018年第1卷第1期 BACHU MEDICAL, JOURNAI,2018,Vo.1,No1 电针对脑出血大鼠血管内皮生长因子受体表达的影响 吴秀清周华军 (三峡大学第一临床医学院[宜昌市中心人民医院]神经内科8.三峡大学神经病学研究所,湖北宜昌443003) 摘要:目的:通过观察针刺足三里对脑出血后大鼠脑内血管内皮生长因子受体( VEGFR)-1和-2表 达的影响,以进一步探讨针剌足三里治疗脑出血的可能作用机理。方法:72只SD大鼠随机分为3 组:脑出血组、针刺组和假针刺组,每组24只,Ⅶ型胶原酶0.5U通过立体定向注入脑内苍白球复 制脑出血模型。针刺组针刺大鼠双侧足三里,假针刺组针剌大鼠双侧非经非穴处皮肤。采用免疫 组织化学方法检测 VEGFR-1和-2在脑出血组3、7、14d表达空间位置变化;运用实时荧光定量 PCR(RT-PCR)检测 VEGFR-1和-2mRNA在3、7、14d的表达水平。结果:脑出血后3d时损伤 区周围可检测到 VEGFR-1和-2阳性微血管段,7d时阳性微血管段增多并伸入血肿区,至14d时 血肿区即出现阳性微血管段。脑出血后 VEGFR-1和-2mRNA表达丰度逐渐增加,且持续至14d (P<0.05)。针剌组 VEGFR-1和-2mRNA表达水平较同时间点脑出血组明显增高(P<0.05),而 假针刺组与脑出血组比较差异无统计学意义。结论:针刺足三里通过上调 VEGFR-1和-2在脑出 血大鼠脑内的表达水平参与脑出血损伤区的血管新生过程,从而实现损伤组织的修复。 关键词:脑出血;血管新生;血管内皮生长因子受体;电针;足三里 中图分类号:R743.34 文献标识码:A Effect of Electroacupuncture on Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor in Rat brains Following Intracerebral Hemorrhage Wu Xiuying Zhou huajun Department of Neurology, Yichang Central People,s Hospital, The First College of Clinical Medical S ence,China Three Gorges University & Institute of Neurology, China Three Gorges University, Yichang 443003, China) Abstract Objective: To investigate the effect of electroacupuncture(EA) at Zusanli on expression of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-1 and-2 in intracerebral hemorrhagic(ICH)rat brains. Meth ods: Collagenase type \l was injected into right globus pallidus to induce ICH model. Seventy two Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups, including ICH-no Ea group, ICH-EA at Zusanli acu- point and ICH-EA at non-acupoint group ea was applied to bilateral Zusanli (ST36) acupoint in the ICH-EA at Zusanli acupoint group or skin without acupoint in the ICH-EA at non-acupoint group. The expression of FR-1 and -2 were assayed by immunohistochemistry at day 3, 7, 14 after the onset. The mRNA expres sion of VEGFR-1 and-2 were evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)at da 3,7, 14 after ICH. Results: The positive vessels of vEGFR-1 and-2 were observed at the of clot at day 3, and then the positive vessels gradually penetrated into hemotoma at day 7 and found in the hematoma area at day 14 after ICH. The expression of VEGFR-1 and-2 mRNA in ICH model group were increased gradual 基金项目:国家自然科学青年基金项目(No:81202625);湖北省自然科学基金项目(No:2017CFB468) 作者简介:吴秀清,女,主管护师,研究方向为脑血管病,E-mail33491221854@qg.com 通讯作者:周华军,男,博士,主治医师,主要从事脑血管疾病的临床与基础研究。E-mail:zhouhuajunt02@126.com
基金项目:国家自然科学青年基金项目(No:81202625);湖北省自然科学基金项目(No:2017CFB468) 作者简介:吴秀清,女,主管护师,研究方向为脑血管病。E-mail:3491221854@qq.com 通讯作者:周华军,男,博士,主治医师,主要从事脑血管疾病的临床与基础研究。E-mail:zhouhuajun02@126.com 电针对脑出血大鼠血管内皮生长因子受体表达的影响 吴秀清 周华军 (三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院]神经内科 & 三峡大学 神经病学研究所,湖北 宜昌 443003) 摘要:目的:通过观察针刺足三里对脑出血后大鼠脑内血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1和-2表 达的影响,以进一步探讨针刺足三里治疗脑出血的可能作用机理。方法:72只SD 大鼠随机分为3 组:脑出血组、针刺组和假针刺组,每组24只,Ⅶ型胶原酶0.5U 通过立体定向注入脑内苍白球复 制脑出血模型。针刺组针刺大鼠双侧足三里,假针刺组针刺大鼠双侧非经非穴处皮肤。采用免疫 组织化学方法检测 VEGFR-1和-2在脑出血组3、7、14d表达空间位置变化;运用实时荧光定量 PCR(RT-PCR)检测 VEGFR-1和-2mRNA 在3、7、14d的表达水平。结果:脑出血后3d时损伤 区周围可检测到 VEGFR-1和-2阳性微血管段,7d时阳性微血管段增多并伸入血肿区,至14d时 血肿区即出现阳性微血管段。脑出血后 VEGFR-1和-2mRNA 表达丰度逐渐增加,且持续至14d (P<0.05)。针刺组 VEGFR-1和-2mRNA 表达水平较同时间点脑出血组明显增高(P<0.05),而 假针刺组与脑出血组比较差异无统计学意义。结论:针刺足三里通过上调 VEGFR-1和-2在脑出 血大鼠脑内的表达水平参与脑出血损伤区的血管新生过程,从而实现损伤组织的修复。 关键词:脑出血; 血管新生; 血管内皮生长因子受体; 电针; 足三里 中图分类号:R743.34 文献标识码:A EffectofElectroacupunctureonExpressionofVascularEndothelialGrowth FactorReceptorinRatBrainsFollowingIntracerebralHemorrhage WuXiuqing ZhouHuajun (DepartmentofNeurology,YichangCentralPeople’sHospital,TheFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity & InstituteofNeurology,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang 443003,China) Abstract Objective:Toinvestigatetheeffectofelectroacupuncture(EA)atZusanlionexpressionofvascular endothelialgrowthfactorreceptor(VEGFR)-1and-2inintracerebralhemorrhagic(ICH)ratbrains.Methods:CollagenasetypeⅦ wasinjectedintorightglobuspallidustoinduceICH model.SeventytwoSpragueDawleyratswererandomlydividedintothreegroups,includingICH-noEAgroup,ICH-EAatZusanliacupointandICH-EAatnon-acupointgroup.EAwasappliedtobilateralZusanli(ST36)acupointintheICH-EA atZusanliacupointgrouporskinwithoutacupointintheICH-EAatnon-acupointgroup.Theexpressionof VEGFR-1and-2wereassayedbyimmunohistochemistryatday3,7,14aftertheonset.ThemRNAexpressionofVEGFR-1and-2wereevaluatedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)atday 3,7,14afterICH.Results:ThepositivevesselsofVEGFR-1and-2wereobservedattheedgeofclotatday 3,andthenthepositivevesselsgraduallypenetratedintohemotomaatday7andfoundinthehematomaarea atday14afterICH.TheexpressionofVEGFR-1and-2mRNAinICH modelgroupwereincreasedgradual- ·1· 巴楚医学 2018年第1卷第1期 BACHU MEDICALJOURNAL,2018,Vol.1,No.1
巴楚医学2018年第1卷第1期 BACHU MEDICAI. JOURNAI,2018,Vol.1,No1 ly, and peaked at day 14(P<0.05). ea at the Zusanli acupoint could up-regulate the expression of vEgFr-1 and-2 at mRNA level. However, Ea at the non-acupoint had little effect on the expression of vegFR-1 and -2. Conclusion: These findings suggest that Ea at the Zusanli acupoint can accelerate ICh sis and up-regulate VEGFR-1 and-2 mRNA levels in rats, which may enhance the recovery following hemor agic cerebral ll Keywords intracerebral hemorrhage; angiogenesis; vascular endothelial growth factor rece troacupuncture; zusanli 脑出血( intracerebral hemorrhage,lCH)是一种 StoelTing TI-2鼠脑定位仪(美国),TC-512型 危重的脑卒中亚型。在全球范围内脑出血具有很高PCR仪(英国 Techne公司),荧光定量PCR仪(德国 的发病率、致死率和致残率口。目前针灸治疗已经被 Roche diagnostics),罗氏毛细硅管(德国 Roche),低 广泛应用于临床治疗脑出血后的神经功能缺损。临温高速离心机(美国 Sigma公司)。 床观察显示,针刺足三里具有促进中风患者神经功能14脑出血动物复制 恢复之功效。基础研究也证明,针刺足三里能抑制 以10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉大 脑出血后神经细胞凋亡,促进神经功能恢复 鼠,麻醉后将大鼠取俯卧位并固定于鼠脑立体定位 血管内皮生长因子受体( vascular endothelia仪,按无菌操作原则,将0.5UⅦ型胶原酶立体定向注 growth factor receptor, VEGFR)-1和-2是血管内皮入苍白球(定位前囟后1.4mm,旁开3.2mm,深 生长因子( vascular endothelial growth factor,5.6mm)【8 VEGF)特异性受体,VEGF通过与 VEGFR-1和-21.5针刺干预 的结合,启动微血管新生中的初始过程,并最终形成 参照实验动物穴位图谱(由中国针灸学会实验针 成熟的血管结构[。研究显示:脑出血后ⅤEGF及灸委员会制定),选取双侧“足三里”为针刺穴位(定位 其受体ⅤEGFR-1和-2表达明显上调,且针刺足三于大鼠后肢膝关节下方腓骨小头内侧5mm),使用 里能通过上调VEGF的表达而促进脑出血后的血管华佗牌针具(0.3mm×25mm),平刺5~7mm,应用 新生过程[。为进一步研究针刺足三里对促进脑出G6805-2型电针仪(上海医疗器械高技术公司),电流 血后血管新生的作用机制,本实验选用针刺足三里干强度2mA,以局部皮肤肌肉轻微颤抖为度,每次电针 预大鼠脑出血模型,观察针刺足三里对脑出血脑内时间为20min,1次/d,疏~密波,频率2~15Hz VEGFR-1和-2表达的影响。 假针刺组以同样的方法针刺双侧非经非穴处皮肤(足 三里外侧旁开5mm)。 1材料与方法 1.6免疫组织化学(ABC法)检测ⅤEGFR-1和-2的 时空分布 1.1动物 术后3、7、14d随机抽取大鼠3只,10%水合氯 雄性 Sprague- Dawley大鼠72只,3月龄,体重醛(4oomg/kg)腹腔注射麻醉,打开胸腔,暴露心脏, 180~220g,购于中南大学实验动物学部[许可证号:经升主动脉先以恒温37℃生理盐水冲洗,再以4℃的 SDXK(湘)2006-0002]。饲养于中南大学实验动物学多聚甲醛(0.1mol/LPBS配制,pH7.4)灌注 部,动物自由进食进水。动物房7:00-19:00光暗交(10mL/min)固定后分离取脑,随后脑组织置于4℃ 替,相对湿度55%,温度2℃。动物适应环境1周后的多聚甲醛中后固定4h后,依次置于梯度蔗糖溶液 开始实验。将大鼠随机分为脑出血组、针刺组和假针(10%,20%,30%,0.1mol/LPBS配制,pH7.4)至 刺组,每组24只。 沉底以脱水。采用 Leica850冰冻切片机行连续冠 1.2试剂 状切片,厚度30μm,4℃冰箱保存备用。采用SAB Ⅶ型胶原酶( Sigma公司), Trizol(MRC公司),法进行 VEGFR-1和或 VEGFR-2染色,1%BSA代 逆转录试剂盒 Tag dna聚合酶, dNTPmix(均为美替一抗作阴性对照。冰冻切片于37℃复温后,采用 国 Fermentas公司),小鼠抗大鼠ⅤEGFR-1、VEG-0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,随后用3%H2O FR2单克隆抗体( Santa cruz公司),ABC试剂盒阻断内源性的过氧化酶。PBS漂洗后,以5%小牛血 ( Vector公司) 清白蛋白封闭1h,加入一抗(小鼠抗大鼠 VEGFR-1 1.3主要仪器 或 VEGFR-2单克隆抗体,浓度均为1:200)37℃孵
ly,andpeakedatday14(P<0.05).EAattheZusanliacupointcouldup-regulatetheexpressionofVEGFR-1 and-2atmRNAlevel.However,EAatthenon-acupointhadlittleeffectontheexpressionofVEGFR-1and -2.Conclusion:ThesefindingssuggestthatEAattheZusanliacupointcanaccelerateICH-inducedangiogenesisandup-regulateVEGFR-1and-2mRNAlevelsinrats,whichmayenhancetherecoveryfollowinghemorrhagiccerebralinjury. Keywords intracerebralhemorrhage; angiogenesis; vascularendothelialgrowthfactorreceptor; electroacupuncture; zusanli 脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH)是一种 危重的脑卒中亚型。在全球范围内脑出血具有很高 的发病率、致死率和致残率[1]。目前针灸治疗已经被 广泛应用于临床治疗脑出血后的神经功能缺损。临 床观察显示,针刺足三里具有促进中风患者神经功能 恢复之功效[2]。基础研究也证明,针刺足三里能抑制 脑出血后神经细胞凋亡,促进神经功能恢复[3,4]。 血管 内 皮 生 长 因 子 受 体 (vascularendothelial growthfactorreceptor,VEGFR)-1和-2是血管内皮 生 长 因 子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)特 异 性 受 体,VEGF 通 过 与 VEGFR-1 和-2 的结合,启动微血管新生中的初始过程,并最终形成 成熟的血管结构[5]。研究显示:脑出血后 VEGF 及 其受体 VEGFR-1和-2表达明显上调[6],且针刺足三 里能通过上调 VEGF的表达而促进脑出血后的血管 新生过程[7]。为进一步研究针刺足三里对促进脑出 血后血管新生的作用机制,本实验选用针刺足三里干 预大鼠脑出血模型,观察针刺足三里对脑出血脑内 VEGFR-1和-2表达的影响。 1 材料与方法 1.1 动物 雄性 Sprague-Dawley大鼠 72 只,3 月龄,体重 180~220g,购于中南大学实验动物学部[许可证号: SDXK(湘)2006-0002]。饲养于中南大学实验动物学 部,动物自由进食进水。动物房7:00-19:00光暗交 替,相对湿度55%,温度22℃。动物适应环境1周后 开始实验。将大鼠随机分为脑出血组、针刺组和假针 刺组,每组24只。 1.2 试剂 Ⅶ型胶原酶(Sigma公司),Trizol(MRC 公司), 逆转录试剂盒,TaqDNA 聚合酶,dNTPmix(均为美 国 Fermentas公 司),小 鼠 抗 大 鼠 VEGFR-1、VEGFR-2单 克 隆 抗 体 (SantaCruz公 司),ABC 试 剂 盒 (Vector公司)。 1.3 主要仪器 StoelTingTL-2鼠脑定位仪(美国),TC-512 型 PCR仪(英国 Techne公司),荧光定量 PCR 仪(德国 RocheDiagnostics),罗氏毛细硅管(德国 Roche),低 温高速离心机(美国Sigma公司)。 1.4 脑出血动物复制 以10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉大 鼠,麻醉后将大鼠取俯卧位并固定于鼠脑立体定位 仪,按无菌操作原则,将0.5U Ⅶ型胶原酶立体定向注 入苍白 球 (定 位 前 囟 后 1.4 mm,旁 开 3.2 mm,深 5.6mm)[8]。 1.5 针刺干预 参照实验动物穴位图谱(由中国针灸学会实验针 灸委员会制定),选取双侧“足三里”为针刺穴位(定位 于大鼠后肢膝关节下方腓骨小头内侧5 mm),使用 华佗牌针具(0.3mm×25mm),平刺5~7mm,应用 G6805-2型电针仪(上海医疗器械高技术公司),电流 强度2mA,以局部皮肤肌肉轻微颤抖为度,每次电针 时间为 20 min,1 次/d,疏 ~ 密波,频率 2~15 Hz。 假针刺组以同样的方法针刺双侧非经非穴处皮肤(足 三里外侧旁开5mm)。 1.6 免疫组织化学(ABC 法)检测 VEGFR-1和-2的 时空分布 术后3、7、14d随机抽取大鼠3只,10%水合氯 醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉,打开胸腔,暴露心脏, 经升主动脉先以恒温37℃生理盐水冲洗,再以4℃的 多 聚 甲 醛 (0.1mol/L PBS 配 制,pH 7.4)灌 注 (10mL/min)固定后分离取脑,随后脑组织置于4℃ 的多聚甲醛中后固定4h后,依次置于梯度蔗糖溶液 (10%,20%,30%,0.1 mol/LPBS配制,pH7.4)至 沉底以脱水。采用 Leica1850 冰冻切片机行连续冠 状切片,厚度30μm,4℃冰箱保存备用。采用 SABC 法进行 VEGFR-1和或 VEGFR-2染色,1% BSA 代 替一抗作阴性对照。冰冻切片于37℃复温后,采用 0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,随后用3% H2O2 阻断内源性的过氧化酶。PBS漂洗后,以5%小牛血 清白蛋白封闭1h,加入一抗(小鼠抗大鼠 VEGFR-1 或 VEGFR-2单克隆抗体,浓度均为1∶200)37℃孵 ·2· 巴楚医学 2018年第1卷第1期 BACHU MEDICALJOURNAL,2018,Vol.1,No.1
巴楚医学2018年第1卷第1期 BACHU MEDICAL, JOURNAI,2018,Vo.1,No1 育1h,4℃冰箱过夜。滴加生物素标记山羊抗小鼠 采用 Trizol方法提取总RNA,紫外分光光度计 IgG(1:100)和ABC复合物(1:100)37℃孵育各检测总RNA纯度。按逆转录试剂盒说明书操作,在 1h,DAB显色 逆转录酶的作用下,将总RNA逆转录为cDNA,以 1.7荧光定量RT-PCR组织处理方 β- actin为内参行PCR扩增。扩增条件:95℃预变性 各组分别于术后3、7、14d处死动物,分离出以3min,95℃5s,60℃34s,76℃5min,共40个循环, 苍白球(血肿)为中心的脑髓质约100mg并置于冻存生成 VEGFR-1和-2的溶解曲线和扩增曲线。根据 管,浸入液氮后,-80℃保存备用。 扩增曲线,对cDNA的含量进行定量分析,2-4法统 1.8荧光定量 RT-PCR方法检测ⅤEGFR-1和2计分析数据[。 mRNA表达 1.9统计学方法 1.8.1引物序列 所有数据采用SPSS12.0软件包进行统计分析 引物由上海英骏生物工程公司合成纯化,具体的计量资料以x±表示,多组间比较用方差分析 引物序列如下: VEGFR-1:F:5- TACCCGCAACG-( ANOVA)。方差齐时,采用LSD检验;方差不齐 GAGAA-3′,R:5′- GGCTTGGAAGGGACGA-3′;时,采用 Dunnetts T3检验,检验水准a为0.05。 VEGFR-2:F:5′- AACGCTTGCCTTATGAT-3’,R 5- AAGTCGCTGTCTTGTCG3'; B-actin:F:5-2结果 TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3′,R:5′ CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG3′。 21 VEGFR-1和-2在脑出血组不同时间点的表达 2提取总RNA 位置变化 VEGFR- VEGFR-2 注:脑出血后3d在血肿周围可检测到 VEGFR-1和-2的阳性微血管段,7d后 VEGFR-1和-2阳性微血管段逐 渐伸入血肿区,且开始出现分枝,至14d血肿区出现阳性血管段(黑色箭头所指为阳性微血管段,比例尺100 m,DAB染色 图1脑出血后 VEGFR-1和-2的表达位置变化 14d ■脑出血组口针刺组■假针刺组 注:脑出血组与前一时间点比较:·P<0.05,·P<0.01;与脑出血组同时间点比较:P<0.05,◇°P<0.01 图2针刺后 VEGFR-1和-2mRNA表达变化
育1h,4℃冰箱过夜。滴加生物素标记山羊抗小鼠 IgG(1∶100)和 ABC 复合物(1∶100)37℃ 孵 育 各 1h,DAB显色。 1.7 荧光定量 RT-PCR组织处理方法 各组分别于术后3、7、14d处死动物,分离出以 苍白球(血肿)为中心的脑髓质约100mg并置于冻存 管,浸入液氮后,-80℃保存备用。 1.8 荧 光 定 量 RT-PCR 方 法 检 测 VEGFR-1 和-2 mRNA表达 1.8.1 引物序列 引物由上海英骏生物工程公司合成纯化,具体的 引物 序 列 如 下:VEGFR-1:F:5'-TACCCGCAACGGAGAA-3', R:5'-GGCTTGGAAGGGACGA-3'; VEGFR-2:F:5'-AACGCTTGCCTTATGAT-3',R: 5'-AAGTCGCTGTCTTGTCG-3';β-actin:F:5'- TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3',R:5'- CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。 1.8.2 提取总 RNA 采用 Trizol方法提取总 RNA,紫外分光光度计 检测总 RNA 纯度。按逆转录试剂盒说明书操作,在 逆转录酶的作用下,将总 RNA 逆转录为cDNA,以 β-actin为内参行 PCR 扩增。扩增条件:95℃预变性 3min,95℃5s,60℃34s,76℃5min,共40个循环, 生成 VEGFR-1和-2的溶解曲线和扩增曲线。根据 扩增曲线,对cDNA 的含量进行定量分析,2-ΔΔCt法统 计分析数据[9]。 1.9 统计学方法 所有数据采用SPSS12.0软件包进行统计分析, 计量资 料 以 x ±s 表 示,多 组 间 比 较 用 方 差 分 析 (ANOVA)。方 差 齐 时,采 用 LSD 检 验;方 差 不 齐 时,采用 Dunnett'sT3检验,检验水准α为0.05。 2 结果 2.1 VEGFR-1和-2在脑出血组不同时间点的表达 位置变化 注:脑出血后3d在血肿周围可检测到 VEGFR-1和-2的阳性微血管段,7d后 VEGFR-1和-2阳性微血管段逐 渐伸入血肿区,且开始出现分枝,至14d血肿区出现阳性血管段(黑色箭头所指为阳性微血管段,比例尺100 μm,DAB染色) 图1 脑出血后 VEGFR-1和-2的表达位置变化 注:脑出血组与前一时间点比较:*P<0.05,**P<0.01;与脑出血组同时间点比较:◇P<0.05,◇◇P<0.01 图2 针刺后 VEGFR-1和-2mRNA 表达变化 ·3· 巴楚医学 2018年第1卷第1期 BACHU MEDICALJOURNAL,2018,Vol.1,No.1
巴楚医学2018年第1卷第1期 BACHU MEDICAI. JOURNAI,2018,Vol.1,No1 本实验用免疫组化观察到,脑出血后3d时损伤足阳明胃经之合穴,具有调和气血、健脾和胃、通经活 区周围可检测到ⅤEGFR-1和-2阳性微血管段,7d络、扶正培元之功效。临床观察显示,针剌足三里能 时 VEGFR-1和-2阳性微血管段增多,并伸入血肿明显改善脑出血患者的神经功能缺损[2。同时动物 区,至14d时血肿区即出现阳性微血管段(见图1)。实验也证实针刺足三里能上调VEGF在脑缺血和脑 22针刺足三里对脑出血后ⅤEGFR-1和-2mRNA出血大鼠脑内的表达20。本实验在采用针刺足三 表达的影响 里干预后, VEGFR-1和-2的表达较脑出血明显升 为评价针刺足三里对脑出血大鼠脑内 VEGFR-1高,提示针刺足三里可能通过上调 VEGFR1和-2的 和-2mRNA表达的影响,本实验采用荧光定量PCR表达,促进血管内皮细胞出芽和增殖,从而有利于损 检测其在各组不同时间点的表达变化。结果显示:脑伤组织功能的修复。究其机制可能与以下两个方面 出血后 VEGFR-1和-2mRNA表达丰度逐渐增加,有关:(1)针刺足三里可通过促进ⅤEGF的表达而诱 且一直持续到 (P<0.05)。 VEGFR-1和导 VEGFR-1和-2的表达上调[0;(2)针剌足三里 -2mRNA在针刺组的表达水平均明显高于同时间点能抑制TNF-a的表达,使 VEGFR-1和-2受抑制程 二者在脑出血组中的表达(P<0.05),而同时间点度降低,从而反馈性的上调 VEGFR1和-2的表 VEGFR1和2mRNA在假针刺组中的表达与脑出达[2.21 血组比较,差异无统计学意义(见图2) 综上所述,本实验结果证明针刺足三里能显著上 调脑出血 VEGFR-1和-2的表达,从而促进了损伤区 3讨论 血管新生过程 VEGFR1和-2是VEGF的2个特异性酪氨酸参考文献 激酶受体,主要表达于血管内皮细胞。在血管新生过 程中,VEGF通过与 VEGFR-1和-2结合从而促使血[1]LuL, Wang L, Wong K s,etal. Stroke and stroke 管内皮细胞出芽,形成新生血管; VEGFR-1主要介导 care in China: huge burden, significant workload, and a 细胞骨架重排引起细胞迁移,调控细胞的适度增殖和 national priority[J]. Stroke, 2011, 42(12): 3651-3654. 有组织地组合。而 VEGFR2在 VEGFR-1的协调下[2]KoCN,Leew, Cho SY,etal. Acupuncture for cer- 发挥主导受体的作用,是决定内皮细胞有丝分裂和增 bral vasospasm after subarachnoid hemorrhage: a ret 殖的关键因素012 respective case-control study [J]. J Altern Complen Med,2013,19(5):471-473 既往研究发现,脑缺血后 VEGFR-1和-2表达上 [3 Cho N H, Lee J D, Cheong B S, et al. Acupuncture 调,参与调节脑缺血后血管新生,有利于神经功能恢 suppresses intrastriatal hemorrhage-induced apoptotic 复[1。与脑缺血研究结果相似,本实验结果显示脑 ronal cell death in rats[J]. Neurosci Lett,2004,362 出血后 VEGFR-1和-2表达逐渐增加,提示ⅤEGFR (2):141-145 1和-2可能通过调节内皮细胞增殖、迁移和重组,从[4] Yang Y j, Kim Y s, Shin m s,etal. Effects of acu- 而参与脑出血后血管新生过程的调控。由于VEG- puncture on the intrastriatal hemorrhage-induced FR-1和-2的表达受多种因子的调控,包括缺氧诱导 caspase3 expression and newly cell birth in rats [J] 因子-1a( hypoxia- inducible factor 1a,HIF-1a)、 Neurol Res, 2007, 29(Suppl 1): S65-71 VEGF以及炎症因子,如肿瘤坏死因子-1a( tumor[] Shibuya M. VEGF-VEGFR signals in health and disease necrosis factor1a,TNF-1a)。HIF-1a和VEGF可 [JJ. Biomol Ther(Seoul), 2014, 22(1): 1-9 以促进ⅤEGFR1和2表达[11,而TNF1a则抑制[6] Tang T, Liu xj, Zhang Z Q,eta. Cerebral angiogenic- VEGFR-1和-2的表达。研究证实脑出血后HIF 1a、VEGF和TNF-a表达明显升高[,1101,脑出血早 rats[J]. Brain Res,2007,1175(1):134-142 [冂]吴婧,唐涛,周华军,等.电针对脑出血大鼠血管 期HIF-1a、VEGF和TNF-1a共同参与调节VEG- 内皮生长因子mRNA表达的影响[J].2010,7(19) FR-1和-2的表达,而脑出血后期,VEGF表达逐渐增 1172-1174 强,TNF-la的表达逐渐降低,因此本实验中VEG[8] Rosenberg G A.Mun- Bryce S, Wesley M,etal.Coll FR-1和-2的表达随着时间延长逐渐升高。 genase-induced intracerebral hemorrhage in rats [J]. 脑出血属于祖国医学“中风”范畴,其病理以风 Stroke,1990,21(5):801-807 火、痰、瘀、虚为特征,病机多为本虚标实。足三里为[9] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene
本实验用免疫组化观察到,脑出血后3d时损伤 区周围可检测到 VEGFR-1和-2阳性微血管段,7d 时 VEGFR-1 和-2 阳性微血管 段 增 多,并 伸 入 血 肿 区,至14d时血肿区即出现阳性微血管段(见图1)。 2.2 针刺足三里对脑出血后 VEGFR-1和-2mRNA 表达的影响 为评价针刺足三里对脑出血大鼠脑内 VEGFR-1 和-2mRNA 表达的影响,本实验采用荧光定量 PCR 检测其在各组不同时间点的表达变化。结果显示:脑 出血后 VEGFR-1和-2 mRNA 表达丰度逐渐增加, 且一 直 持 续 到 14 d(P <0.05)。VEGFR-1 和 -2mRNA在针刺组的表达水平均明显高于同时间点 二者在脑出血组中的表 达 (P <0.05),而 同 时 间 点 VEGFR-1和-2mRNA 在假针刺组中的表达与脑出 血组比较,差异无统计学意义(见图2)。 3 讨论 VEGFR-1和-2是 VEGF 的2个特异性酪氨酸 激酶受体,主要表达于血管内皮细胞。在血管新生过 程中,VEGF通过与 VEGFR-1和-2结合从而促使血 管内皮细胞出芽,形成新生血管;VEGFR-1主要介导 细胞骨架重排引起细胞迁移,调控细胞的适度增殖和 有组织地组合。而 VEGFR-2在 VEGFR-1的协调下 发挥主导受体的作用,是决定内皮细胞有丝分裂和增 殖的关键因素[10-12]。 既往研究发现,脑缺血后 VEGFR-1和-2表达上 调,参与调节脑缺血后血管新生,有利于神经功能恢 复[13]。与脑缺血研究结果相似,本实验结果显示脑 出血后 VEGFR-1和-2表达逐渐增加,提示 VEGFR- 1和-2可能通过调节内皮细胞增殖、迁移和重组,从 而参与脑出血后血管新生过程的调控。由于 VEGFR-1和-2的表达受多种因子的调控,包括缺氧诱导 因 子-1α (hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)、 VEGF以及 炎 症 因 子,如 肿 瘤 坏 死 因 子-1α(tumor necrosisfactor-1α,TNF-1α)。HIF-1α 和 VEGF 可 以促进 VEGFR-1和-2表达[14,15],而 TNF-1α则抑制 VEGFR-1和-2的表达[16]。研究证实脑出血后 HIF- 1α、VEGF和 TNF-α表达明显升高[3,17-19],脑出血早 期 HIF-1α、VEGF 和 TNF-1α共 同 参 与 调 节 VEGFR-1和-2的表达,而脑出血后期,VEGF表达逐渐增 强,TNF-1α的表 达 逐 渐 降 低,因 此 本 实 验 中 VEGFR-1和-2的表达随着时间延长逐渐升高。 脑出血属于祖国医学“中风”范畴,其病理以风、 火、痰、瘀、虚为特征,病机多为本虚标实。足三里为 足阳明胃经之合穴,具有调和气血、健脾和胃、通经活 络、扶正培元之功效。临床观察显示,针刺足三里能 明显改善脑出血患者的神经功能缺损[2]。同时动物 实验也证实针刺足三里能上调 VEGF在脑缺血和脑 出血大鼠脑内的表达[7,20]。本实验在采用针刺足三 里干 预 后,VEGFR-1 和-2 的 表 达 较 脑 出 血 明 显 升 高,提示针刺足三里可能通过上调 VEGFR-1和-2的 表达,促进血管内皮细胞出芽和增殖,从而有利于损 伤组织功能的修复。究其机制可能与以下两个方面 有关:(1)针刺足三里可通过促进 VEGF的表达而诱 导 VEGFR-1和-2的表达上调[7,20];(2)针刺足三里 能抑制 TNF-α的表达,使 VEGFR-1和-2 受抑制程 度降 低,从 而 反 馈 性 的 上 调 VEGFR-1 和-2 的 表 达[21,22]。 综上所述,本实验结果证明针刺足三里能显著上 调脑出血 VEGFR-1和-2的表达,从而促进了损伤区 血管新生过程。 参考文献: [1] LiuL,WangD,WongK S,etal.Strokeandstroke careinChina:hugeburden,significantworkload,anda nationalpriority[J].Stroke,2011,42(12):3651-3654. [2] KoCN,LeeIW,ChoSY,etal.Acupunctureforcerebralvasospasmaftersubarachnoidhemorrhage:aretrospectivecase-controlstudy[J].J Altern Complem Med,2013,19(5):471-473. [3] Cho N H,LeeJD,CheongBS,etal.Acupuncture suppressesintrastriatal hemorrhage-induced apoptotic neuronalcelldeathinrats[J].NeurosciLett,2004,362 (2):141-145. [4] YangYJ,Kim YS,Shin M S,etal.Effectsofacupuncture on the intrastriatal hemorrhage-induced caspase3expressionand newlycellbirthinrats[J]. NeurolRes,2007,29(Suppl1):S65-71. [5] ShibuyaM.VEGF-VEGFRsignalsinhealthanddisease [J].BiomolTher(Seoul),2014,22(1):1-9. [6] TangT,LiuXJ,ZhangZQ,etal.Cerebralangiogenesisaftercollagenase-inducedintracerebralhemorrhagein rats[J].BrainRes,2007,1175(1):134-142. [7] 吴 婧,唐 涛,周华军,等.电针对脑出血大鼠血管 内皮生长 因 子 mRNA 表 达 的 影 响 [J].2010,7(19): 1172-1174. [8] RosenbergGA,Mun-BryceS,WesleyM,etal.Collagenase-inducedintracerebralhemorrhagein rats[J]. Stroke,1990,21(5):801-807. [9] LivakKJ,SchmittgenT D.Analysisofrelativegene ·4· 巴楚医学 2018年第1卷第1期 BACHU MEDICALJOURNAL,2018,Vol.1,No.1
巴楚医学2018年第1卷第1期 BACHU MEDICAL, JOURNAI,2018,Vo.1,No1 expression data using real-time quantitative per and the nos and vegFr2 protein expression in endothelial 2(-delta delta c(t))method[J]. Methods, 2001, 25(4) cells[J]. Int J Immunopathol Pharmacol. 2011, 24(2) 402-408 [1o] Carmeliet P, Collen D. Molecular analysis of [17] Zhou H J, Tang T, Cui H ], et al. Thrombin-triggered mation and disease [J ]. Am J Physiol,1 angiogenesis in rat brains follo wing experimental intrac 5Pt2):H2091-2104. rebral hemorrhage [J]. J Neurosurg, 2012, 117(5) [11] Risau W. Mechanisms of angiogenesis [J].Nature 920-928 1997,386(6626):671-6741 [18] Prunell G F, Svendgaard N A, Alkass K, et al. Inflam [12] Zeng H, Zhao D, Yang S, et al. Heterotrimeric G alpha perimental subarachnoid q/G alpha 11 proteins function upstream of vascular en- hemorrhage[J]. Neurosurgery, 2005, 56(5):1082 dothelial growth factor VEGF) receptor-2( KDR phosphorylation in vascular permeability factor/VEGF [19] Xi G, Keep R F, Hoff J T. Mechanisms of brain injury signaling [J]. J Biol Chem, 2003, 278(23):20738- after intracerebral haemorrhage [J]. Lancet Neurol 745 2006,5(1):53-63 [13] Greenberg D A,JinK. Vascular endothelial growth fac-[20]毛庆菊,陈邦国.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑 tors(VEGFs) and stroke[J]. Cell Mol Life Sci,2013 皮层微血管超微结构及血管内皮生长因子表达的影响 70(10):1753-1761 J].针刺研究,2012,37(6):476-481 [14] Nevo o, Soleymanlou N,wuY,etal. Increased ex-[21]陈素辉,孙华,徐虹,等.针刺对脑缺血再灌注损 pression of sFlt-1 in in vivo and in vitro models of hu- 伤大鼠双侧脑组织自细胞介素-1B、肿瘤坏死因子-a表 man placental hypoxia is mediated by HIF-1[J]. Am J 达的影响[冂].2012,37(6):470-475 Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2006. 291(4): [22] Xu H, Sun H, Chen S H, et al. Effects of acupuncture at Baihui(DU20)and Zusanli (ST36) on the expression [15] Okuyama H, Krishnamachary B, Zhou Y F, et al.Ex of heat shock protein 70 and tumor necrosis factor a in pression of vascular endothelial growth factor receptor 1 the peripheral serum of cerebral ischemia-reperfusion-in jured rats[J]. Chin J Integr Med. 2014,20(5):369- on hypoxia-inducible factor 1[J. J Biol Chem. 2006,281 (22):15554-1556 [16] Altorjay 1, Vereb Z Z, et al. Anti-TNF-alpha 收稿日期2018-04-27] antibody (infliximab) supports the recovery of
expressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe 2(-deltadeltac(t))method[J].Methods,2001,25(4): 402-408. [10]CarmelietP,CollenD.Molecularanalysisofbloodformation and disease[J].Am J Physiol,1997,273 (5Pt2):H2091-2104. [11] Risau W.Mechanismsofangiogenesis[J].Nature, 1997,386(6626):671-6741. [12]ZengH,ZhaoD,YangS,etal.HeterotrimericGalpha q/Galpha11proteinsfunctionupstreamofvascularendothelialgrowthfactor (VEGF)receptor-2 (KDR) phosphorylationinvascularpermeabilityfactor/VEGF signaling[J].JBiolChem,2003,278(23):20738- 20745. [13]GreenbergDA,JinK.Vascularendothelialgrowthfactors(VEGFs)andstroke[J].CellMolLifeSci,2013, 70(10):1753-1761. [14]NevoO,Soleymanlou N,Wu Y,etal.IncreasedexpressionofsFlt-1ininvivoandinvitromodelsofhumanplacentalhypoxiaismediatedbyHIF-1[J].AmJ PhysiolRegulIntegr Comp Physiol,2006,291(4): R1085-1093. [15]OkuyamaH,KrishnamacharyB,ZhouYF,etal.Expressionofvascularendothelialgrowthfactorreceptor1 inbonemarrow-derivedmesenchymalcellsisdependent onhypoxia-induciblefactor1[J].JBiolChem,2006,281 (22):15554-15563. [16]AltorjayI,VerebZ,SerfozoZ,etal.Anti-TNF-alpha antibody(infliximab)therapysupportstherecoveryof eNOSand VEGFR2 proteinexpressioninendothelial cells[J].IntJImmunopatholPharmacol,2011,24(2): 323-335. [17]ZhouHJ,TangT,CuiHJ,etal.Thrombin-triggered angiogenesisinratbrainsfollowingexperimentalintracerebralhemorrhage[J].J Neurosurg,2012,117(5): 920-928. [18]PrunellGF,SvendgaardNA,AlkassK,etal.Inflammationin the brain afterexperimentalsubarachnoid hemorrhage[J].Neurosurgery,2005,56(5):1082- 1092. [19]XiG,KeepRF,HoffJT.Mechanismsofbraininjury afterintracerebralhaemorrhage[J].Lancet Neurol, 2006,5(1):53-63. [20]毛庆菊,陈邦国.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑 皮层微血管超微结构及血管内皮生长因子表达的影响 [J].针刺研究,2012,37(6):476-481. [21]陈素辉,孙 华,徐 虹,等.针刺对脑缺血再灌注损 伤大鼠双侧脑组织白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表 达的影响[J].2012,37(6):470-475. [22]XuH,SunH,ChenSH,etal.Effectsofacupuncture atBaihui(DU20)andZusanli(ST36)ontheexpression ofheatshockprotein70andtumornecrosisfactorαin theperipheralserumofcerebralischemia-reperfusion-injuredrats[J].ChinJIntegr Med,2014,20(5):369- 374. [收稿日期 2018-04-27] ·5· 巴楚医学 2018年第1卷第1期 BACHU MEDICALJOURNAL,2018,Vol.1,No.1