DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100 mM pH 7.5 gCl 10 mM ATP 0.5-1mM DTT 5 mM Volume 10-20 TT 4-15C4-16hr 1UDNA连接酶的酶活性:在最佳反应条件下15℃反应1小时, 完全连接1μg-DNA(Hind川片段)所需的酶量
DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时， 完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量
DNA连接酶 平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲,由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接,而平头末端的连接则属于分子间的连 接,因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括: ●加大连接酶用量(0倍大于粘性末端的连接) 加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞机会 加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用 ●加入单价阳离子(NaC|),最终浓度150-200mM
DNA连接酶 平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|( DNA pol l) 大肠杆菌DNA聚合酶|基本性质:5‘→3“的DNA聚合酶活 驻‘→3‘的核酸外切酶 話怛◆5‘的核酸外切酶活 32… GC-T-C-AG-C-T-G-G-A-G-A…57性 5 C-G-A-G-I。H DNA pol I 5 ppp dN 3‘.. GC-TCAGCTEGAGA.5 5C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 5‘→3‘的DNA聚合酶活 性5‘→3‘的核酸外切酶 活性3‘→5‘的核酸外切酶活 性 大肠杆菌DNA聚合酶 I的基本性质： 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH 5‘ ppp dN Mg2+ 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH DNA pol I
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|( DNA pol l) 大肠杆菌DNA聚合酶|的基本用途: G-C-T-C-A-G-C-TG-G-A-G-T 3 缺口前移标记法 3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A Nick translation 5 DNase I 制备32P标记的探针 5‘… G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T3 3‘. C-GAG-T-C-GA-C-C-TC-A 5‘ DNA pol!lMg25‘dNTP5‘ppdA(a32 P-dATP 5 G-C-T-CA-G-C-TG-G.3 3∴ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 缺口前移标记法 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途： 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（a- 32P-dATP ） 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Nick translation 制备32P标记的探针 DNase I DNA pol I
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|大片段( Klenow) Klenow酶的基本性质: 大肠杄菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端 分之二的大肽段,即为 Klenow酶 Klenow酶仍拥有5→3“的DNA聚合酶活性和3‘→5 胺螫外切酶活性,但失去了5‘→3“的核酸外切酶活性
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow酶的基本性质： 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端 三分之二的大肽段，即为Klenow酶 Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘ 的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性