2.未知样品蛋白质浓度的测定 取样品30m于试管中,加双缩脲试剂2.0m混 匀,于540nm处测定其吸光度,对照标准曲线,求 出蛋白质浓度。 思考题】 1.本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较,有 那些优点? 若样品中有干扰测定的杂质,应该如何校正 实验结果?
2. 未知样品蛋白质浓度的测定 取样品3.0ml于试管中，加双缩脲试剂2.0ml混 匀，于540nm处测定其吸光度，对照标准曲线，求 出蛋白质浓度。 【思考题】 1. 本法与其他测定蛋白质浓度的方法比较，有 那些优点？ 2. 若样品中有干扰测定的杂质，应该如何校正 实验结果？
实验二离子交换法血清纯化lgG 【实验原理】 DEAE-Sephadex A50(二乙氨基-乙基-葡 萄糖凝胶A-50)为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将C|-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白。血清 中的y球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH685 7.5),其余均属酸性蛋白。pH7.2~74的环境 中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A50吸附,只 有y球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则 被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的lgG
实验二 离子交换法血清纯化IgG 【实验原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡 萄糖凝胶 A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用 NaOH 将 Cl - 型转变为 OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清 中的 γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为 pH6.85 ～ 7.5 ），其余均属酸性蛋白。 pH 7.2 ～ 7.4 的环境 中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只 有 γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则 被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的 IgG
【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5 Mo/L Hc和NaOH 3.0.1mo/L pH7. 4 PBS 4. 0.1 mol/L Tris-HCI(pH7. 4) 5.0.02%NaN3 6. PEG 7.无水乙醇 8.紫外分光光度计 9.1cm×20cm玻璃层析柱 10.自动部分收集器
【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2. 0.5mol/L HCl 和 NaOH 3. 0.1mol/L pH7.4 PBS 4. 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5. 0.02 ％ NaN 3 6. PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9. 1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器
【操作步骤】 1. DEAE-Sephadex A-50预处理称DEAE Sephadex A50(下称A-50)5g,悬于500m 蒸馏水内,1h后倾去上层细粒。按每克A50加 05 mol naoh15m|的比例,将浸泡于05moL NaOH液中,搅匀,静置30min,装入布氏漏斗 (垫有2层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至 pH呈中性;再以0.5 mol/L Hcl同上操作过程处理, 最后以0.5 mol/L naoh再处理一次,处理完后,将 A50漫泡于01 mol/L pH74PBs中过夜
【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理 称 DEAESephadex A-50 （下称 A-50 ） 5g ，悬于 500ml 蒸馏水内， 1h 后倾去上层细粒。按每克 A-50 加 0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于 0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置 30min ，装入布氏漏斗 （垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至 pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作过程处理， 最后以 0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将 A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜
2.装柱 (1)将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫 圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 2)将01 mol/L Tris-Hcl(pH74)沿玻璃棒 倒入柱中至14高度,再倒入经预处理并以同上缓冲 液调成稀糊状的A-50。待A-50凝胶沉降2~3cm 高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1mmin,同 时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。 (3)关闭出水口,待A-50凝胶完全沉降后, 柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插 入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶 相连接
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一 圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （ 2 ）将 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒 倒入柱中至 1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲 液调成稀糊状的A-50 。待 A-50 凝胶沉降 2 ～ 3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速 1ml/min ，同 时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待 A-50 凝胶完全沉降后， 柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插 入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶 相连接