急性C0中毒小鼠海马神经元超微结构及Bc-2/Bax观察 吴松王露何莹莹任晶晶王铁涛吴银燕 (安徽医科大学，05本硕) 指导老师：贾雪梅教授 [摘要]目的探讨急性一氧化碳中毒(acute carbon monoxide poisoning, ACOP)后小鼠海马神经元的超微结构及Bc-2和Bax表达情况。方法取 16只小鼠，随机分为实验组8只，对照组8只，实验组进行急性一氧化碳 中毒，7天后，断头取脑，冰冻切片，HE染色、电镜观察、免疫组化染色并 做计算机图像分析。结果HE染色结果显示对照组与实验组结果无明显差 别。与对照组相比，在电镜下，实验组海马神经元内线粒体肿胀，空泡化； 粗面内质网扩张，变少；髓鞘松解，出现核沟等细胞调亡前的形态学特征。 免疫组化染色结果，实验组Bcl-2/Bax比值为0.889±.0081(P<0.05)；对照 组Bcl-2/Bax比值为1.523±.0050(P<0.05)。结论急性一氧化碳中毒有诱 发小鼠海马神经元调亡的趋势，为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依 据。 [关健词]急性一氧化碳中毒，Bc-2,Bax,超微结构，海马，小鼠 在我国北方，急性C0中毒很常见，但约有3%-30%急性C0中毒患者恢复 后会出现神经系统的病变（迟发型脑病），表现为计算力显著下降、记忆力 减退、反应迟钝、部分患者可发展为痴呆综合征。机制目前仍不清楚，大量 研究表明记忆与海马有关，本实验通过复制急性C0中毒小鼠模型，用电镜技 术观察小鼠海马神经元超微结构的变化。1993年KorsmeyerL1-提出 Bcl-2/Bax比率可以调控细胞死亡，于是本实验将通过免疫组化技术检测小
急性 CO 中毒小鼠海马神经元超微结构及 Bcl-2/Bax 观察 吴松 王露 何莹莹 任晶晶 王铁涛 吴银燕 （安徽医科大学，05 本硕） 指导老师：贾雪梅教授 [摘要] 目的 探讨急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning， ACOP）后小鼠海马神经元的超微结构及 Bcl-2 和 Bax 表达情况。 方法 取 16 只小鼠，随机分为实验组 8 只，对照组 8 只，实验组进行急性一氧化碳 中毒，7 天后，断头取脑，冰冻切片，HE 染色、电镜观察、免疫组化染色并 做计算机图像分析。结果 HE 染色结果显示对照组与实验组结果无明显差 别。与对照组相比，在电镜下，实验组海马神经元内线粒体肿胀，空泡化； 粗面内质网扩张，变少；髓鞘松解，出现核沟等细胞凋亡前的形态学特征。 免疫组化染色结果，实验组 Bcl-2/Bax 比值为 0.889±.0081 (P<0.05)；对照 组 Bcl-2/Bax 比值为 1.523±.0050 (P<0.05)。结论 急性一氧化碳中毒有诱 发小鼠海马神经元凋亡的趋势，为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依 据。 [关键词] 急性一氧化碳中毒，Bcl-2，Bax，超微结构，海马，小鼠 在我国北方，急性CO中毒很常见，但约有 3%~30%急性CO中毒患者恢复 后会出现神经系统的病变（迟发型脑病），表现为计算力显著下降、记忆力 减退、反应迟钝、部分患者可发展为痴呆综合征。机制目前仍不清楚，大量 研究表明记忆与海马有关，本实验通过复制急性CO中毒小鼠模型，用电镜技 术观察小鼠海马神经元超微结构的变化。1993 年KorsmeyerL[1-2]提出 Bcl-2/Bax比率可以调控细胞死亡，于是本实验将通过免疫组化技术检测小
鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl-2（抑制凋亡)和bax(促进凋亡)的表达情 况，通过对照分析，从而观察急性C0中毒小鼠海马神经元是否有凋亡的趋势， 期望为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1动物20只昆明小鼠，体重20-25g,雌雄各半，由安徽医科大学实 验动物中心提供（普通级）。 1.1.2试剂C0(自制)，HE染料，4%戊二醛固定液，PBS,免疫组化试剂 盒。 1.1.3仪器冰冻切片机，光学显微镜，电镜（日立JM-1230)。 1.2方法 1.2.1ACOP模型构建取16只昆明种小鼠半随机分为两组，对照组8只， 实验组8只。每天给模型组小鼠进行C0中毒，（中午1次，晚上1次），连续 中毒7天，对照组不吸入C0,同样条件下饲养。第8天，用C0处死实验组 小鼠，颈椎脱臼处死对照组小鼠，取出脑组织，分别作以下处理。 1.2.2HE染色技术苏木精染色，分色，蓝化，脱水，复制伊红染色，分 色，脱水，透明，封片。 1.2.3电镜技术在海马齿状回平面切一约1组织块，放入4%戊二醛固定， 环氧乙烷处理，环氧树脂包埋，包埋组织超薄切片，枸橼酸铅染液，水洗， 日产JEM-1230型透射电镜观察摄片。 1.2.4免疫组化染色技术脑组织冰冻切片，厚度为10mm,固定，过氧 化氢处理，8min;血清封闭，室温孵育15min,倒去，勿洗，滴加一抗（兔抗鼠）
鼠海马神经元凋亡相关蛋白bcl-2（抑制凋亡）和bax（促进凋亡）的表达情 况，通过对照分析，从而观察急性CO中毒小鼠海马神经元是否有凋亡的趋势， 期望为临床上迟发性脑病病理研究提供形态学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 20 只昆明小鼠，体重 20-25g，雌雄各半，由安徽医科大学实 验动物中心提供（普通级）。 1.1.2 试剂 CO（自制），HE 染料，4%戊二醛固定液，PBS，免疫组化试剂 盒。 1.1.3 仪器 冰冻切片机 ，光学显微镜 ，电镜 （日立 JEM-1230）。 1.2 方法 1.2.1 ACOP 模型构建 取 16 只昆明种小鼠半随机分为两组,对照组 8 只， 实验组 8 只。 每天给模型组小鼠进行 CO 中毒,(中午 1 次,晚上 1 次),连续 中毒 7 天，对照组不吸入 CO，同样条件下饲养。第 8 天, 用 CO 处死实验组 小鼠,颈椎脱臼处死对照组小鼠，取出脑组织，分别作以下处理。 1.2.2 HE 染色技术 苏木精染色，分色，蓝化，脱水，复制伊红染色，分 色，脱水，透明，封片。 1.2.3 电镜技术 在海马齿状回平面切一约 1 组织块，放入 4%戊二醛固定， 环氧乙烷处理，环氧树脂包埋，包埋组织超薄切片，枸橼酸铅染液，水洗， 日产 JEM-1230 型透射电镜观察摄片。 1．2.4 免疫组化染色技术 脑组织冰冻切片，厚度为 10mm，固定，过氧 化氢处理, 8min;血清封闭,室温孵育 15min ,倒去,勿洗，滴加一抗（兔抗鼠）
37孵育，滴加二抗（羊抗兔），37孵育；滴加复合物，DAB显色，冲洗。 以上步操作后用PBS洗3次，5min/次。透明，封片，光学显微镜摄片。以 PBS替代一抗做空白对照实验。 1.2.5计算机图像分析对免疫组化染色的小鼠海马CA3区，用计算机形 态分析系统，进行阳性细胞光密度分析。 1.2.6统计学处理采用SSPS分析软件处理数据，数据用X±S表示。 2结果 2.1HE染色结果对照组小鼠海马神经元染色较浅，细胞核大且圆，核仁明 显，胞浆较少。实验组小鼠海马神经元染色浅，排列紊乱，细胞核出现椭圆， 胞浆较多，但总体情况与对照组相同，无明显变化。 2.2电镜结果对照组小鼠海马神经元内粗面内质网较多，呈线状；线粒体 丰富，呈椭圆形，嵴清晰；核糖体及糖原颗粒丰富，核膜清晰，染色质弥散 于核中，可见核仁（图1)。髓鞘正常无松解现象（图2。实验组中粗面内 质网扩张明显；线粒体肿胀，嵴变少，甚至空泡化；细胞水肿，核糖体及糖 原颗粒稀疏，细胞核染色质固缩（图3）。有髓鞘松解（图4）
37 孵育，滴加二抗（羊抗兔）, 37 孵育；滴加复合物， DAB 显色，冲洗。 以上步操作后用 PBS 洗 3 次，5min /次。透明，封片，光学显微镜摄片。以 PBS 替代一抗做空白对照实验。 1.2.5 计算机图像分析 对免疫组化染色的小鼠海马 CA3 区，用计算机形 态分析系统，进行阳性细胞光密度分析。 1.2.6 统计学处理 采用 SSPS 分析软件处理数据，数据用 X±S 表示。 2 结果 2.1 HE 染色结果 对照组小鼠海马神经元染色较浅,细胞核大且圆,核仁明 显，胞浆较少。实验组小鼠海马神经元染色浅，排列紊乱，细胞核出现椭圆， 胞浆较多，但总体情况与对照组相同，无明显变化。 2.2 电镜结果 对照组小鼠海马神经元内粗面内质网较多，呈线状；线粒体 丰富，呈椭圆形，嵴清晰；核糖体及糖原颗粒丰富，核膜清晰，染色质弥散 于核中，可见核仁（图 1）。髓鞘正常无松解现象（图 2）。实验组中粗面内 质网扩张明显；线粒体肿胀，嵴变少，甚至空泡化；细胞水肿，核糖体及糖 原颗粒稀疏，细胞核染色质固缩（图 3）。有髓鞘松解（图 4）
图1对照组小鼠海马CA3区神经元细胞核（★）图2对照组小鼠海马CA3区髓鞘（△） 核膜清晰（☆）线粒体（↑），及粗面内质网（▲） 结构正常×15,000 结构正常×20,000 图3实验组小鼠海马CA3区神经元神经元细 图4实验组小鼠海马CA3区髓鞘松散（△） 胞核质固缩（★），核膜皱褶（☆），线粒体空泡化 ×15,000 (↑)，粗面内质网内膜扩张（▲）×20,000 2.3免疫组化染色结果对照组小鼠海马神经元Bc-2表达于胞质，呈深棕 黄色（图5）；Bx表达于胞质，呈淡棕黄色（图6）。实验组小鼠海马神 经元Bcl-2呈浅黄色（图7）Bax呈深棕色（图8）
图 1 对照组小鼠海马 CA3 区神经元细胞核（★） 图 2 对照组 小鼠海马 CA3 区髓鞘（△） 核膜清晰（☆）线粒体（↑），及粗面内质网（▲） 结构正常×15,000 结构正常×20,000 图 3 实验组 小鼠海马 CA3 区神经元神经元细 图 4 实验组 小鼠海马 CA3 区髓鞘松散（△） 胞核质固缩（★），核膜皱褶（☆），线粒体空泡化 ×15,000 （↑），粗面内质网内膜扩张（▲）×20,000 2.3 免疫组化染色结果 对照组小鼠海马神经元 Bcl-2 表达于胞质，呈深棕 黄色（图 5）； Bax 表达于胞质，呈淡棕黄色（图 6）。 实验组小鼠海马神 经元 Bcl-2 呈浅黄色（图 7）；Bax 呈深棕色（图 8）
50um 50um 图5对照组海马CA3区神经元Bcl-2(SP法)图6对照组海马CA3区神经元bax(SP法) 50um 50um 图7实验组海马CA3区神经元Bcl-2(SP法)图8实验组海马CA3区神经元bax(SP法) 2.4图像分析结果：对照组小鼠海马神经元细胞中Bcl-2和Bax表达的平 均光密度分别为0.142±0.0042和0.093±0.0056，Bcl-2/Bax比值为1.523± 0.0050。实验组小鼠海马神经元细胞中Bcl-2和Bax表达的平均光密度分别 为0.101±0.0076和0.113±0.0100，Bc-2/Ba×比值为0.889±0.0081
图 5 对照组海马 CA3 区神经元 Bcl-2（SP 法） 图 6 对照组海马 CA3 区神经元 bax（SP 法） 图 7 实验组海马 CA3 区神经元 Bcl-2（SP 法） 图 8 实验组海马 CA3 区神经元 bax（SP 法） 2.4 图像分析结果： 对照组小鼠海马神经元细胞中 Bcl-2 和 Bax 表达的平 均光密度分别为 0.142±0.0042 和 0.093±0.0056，Bcl-2/Bax 比值为 1.523± 0.0050。实验组小鼠海马神经元细胞中 Bcl-2 和 Bax 表达的平均光密度分别 为 0.101±0.0076 和 0.113±0.0100，Bcl-2/Bax 比值为 0.889±0.0081