刘新文,重组DNA技术 第二节DNA克隆的基本过程 ■分、切、接、转、筛、表达 、“分”:目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法:化学合成、PCR、基因组文库、 cDNA文库 >聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR): 在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特 异引物及耐热的DNA聚合酶(常用Iaq酶),经多次 变性、退火、延伸循环反应,使目的DNA呈指数合 成的过程
刘新文，重组DNA技术 第二节 DNA克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达 一、 “分” ：目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、 cDNA文库 Ø聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）： 在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特 异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次 变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合 成的过程
刘新文,重组DNA技术 >cDNA文库( CDNA library):以mRNA为模板,利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链 CDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受 体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用 于筛选编码蛋白质的结构基因。 >基因组DNA文库( genomic dna library):利用限制 性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与 适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所 有基因组DNA信息,总称基因组DNA文库
刘新文，重组DNA技术 ØcDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受 体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用 于筛选编码蛋白质的结构基因。 Ø基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制 性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与 适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所 有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库
刘新文,重组DNA技术 2、常用载体:质粒、噬菌体、病毒DNA >克隆载体( loning vector):用于目的基因的克隆、 扩增、序列分析和体外定点突变等 >表达载体( Expression vector):用于在宿主细胞中表达 外源目的基因,获得大量表达产物 、“切”:限制性內切酶切割目的基因和载体 ￥A“接”:重组体的构建 四、“转”:重组DNA分子导入受体细胞 、转化( transformation):将质粒或其它外源 DNA导入宿主细胞常用大肠杆菌),并使其获得新的 表型的过程
刘新文，重组DNA技术 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA Ø克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、 扩增、序列分析和体外定点突变等 Ø表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达 外源目的基因，获得大量表达产物 二、 “切” ：限制性内切酶切割目的基因和载体 D三N、A“接” ：重组体的构建 四、 “转” ：重组DNA分子导入受体细胞 1、转化（transformation）：将质粒或其它外源 DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的 表型的过程
刘新文,重组DNA技术 2、转染( transfection):将外源DNA导入真核细胞 的过程 3、感染( transfection):以λ噬菌体、柯斯质粒和 病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具 有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的 细胞,并在细胞内扩增。也称为转导( transduction) 五、“筛”:筛选出含重组DNA的受体细胞γ 1、直接选择法:遗传标记【抗药性标志选择、营 养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂 交)】 2、非直接选择法:免疫化学法、酶联免疫检测法
刘新文，重组DNA技术 2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞 的过程 3、感染（transfection）：以l噬菌体、柯斯质粒和 病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具 有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的 细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction） 五、 “筛” ：筛选出含重组DNA的受体细胞 1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营 养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂 交）】 2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法
刘新文,重组DNA技术 、“表达”:使克隆基因在宿主细胞中复制、表 连、外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶 性的包涵体 2、真核表达体系:酵母、昆虫及哺乳动物细胞等
刘新文，重组DNA技术 六、 “表达” ：使克隆基因在宿主细胞中复制、表 达1、外源基因在原核细胞的表达 Ø大肠杆菌是最常用的原核表达体系 Ø真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶 性的包涵体 2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等