1、化学法直接合成基因 基因的组装过程 方法1 方法1 ligase Klenow fragments I MCS
基因的组装过程 1、化学法直接合成基因 方法1 方法1 ligase Klenow fragments MCS
第一节目的DNA片段的获得 1、化学法直接合成 2、从基因组文库中钓取 3、从cDNA文库中钓取 4、通过PCR直接扩增
第一节 目的DNA片段的获得 1、化学法直接合成 2、从基因组文库中钓取 3、从cDNA文库中钓取 4、通过PCR直接扩增
2、从基因组文库中钓取 基因文库( gene library)是指汇集了某一生物基因组 DNA全部序列的重组体DNA群体(转化子群)。 基因组文库的大小(即应该包含多少个独立的克隆)与基 因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关 克隆片段 基因组的大小(bp) 的平均2×106(细菌)2×107(真菌) 3×109(动物) 大小(bp理论数实际数理论数实际数理论数实际数 5×10 4001831 400018418 60000027631109 10×103200 919 20009208 3000001381550 20×10 100 458 10004603 150000690774 40×10 50 278 5002300 75000354386
2、从基因组文库中钓取 基因文库（gene library）是指汇集了某一生物基因组 DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。 基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基 因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关。 基因组的大小（bp） 2×106（细菌） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 理论数 实际数 克隆片段 的平均 大小（bp） 5×103 400 1831 4000 18 418 600 000 27 631 109 10× 103 200 919 2000 9 208 300 000 1 381 550 20× 103 100 458 1000 4 603 150 000 690 774 40× 103 50 278 500 2 300 75 000 354 386
2、从基因组文库中钓取 因为基因组DNA片段是随即克隆的,所以基因组大小除 以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值,从统计学的角度 分析,从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有 50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时,克隆到特定DNA 片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的几率以克 隆到目的基因,一个完整的基因组文库就必须含有3-10 倍于最低重组克隆数的克隆。 1975年,L. Clarke和J. Carbon提出了一个计算完全基因 组文库所需实际克隆数的公式:N=n(1-p)/n(1-。其中,N代 表实际克隆数;p代表在重组群体中出现特定基因的几率 般的期望值都为99%);玳代表限制性片段的平均大小与相应生 物体基因组大小的比值
2、从基因组文库中钓取 因为基因组DNA片段是随即克隆的，所以基因组大小除 以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角度 分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有 50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特定DNA 片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的几率以克 隆到目的基因，一个完整的基因组文库就必须含有3-10 倍于最低重组克隆数的克隆。 1975年，L. Clarke和J. Carbon提出了一个计算完全基因 组文库所需实际克隆数的公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中，N代 表实际克隆数；p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一 般的期望值都为99%）；f代表限制性片段的平均大小与相应生 物体基因组大小的比值
2、从基因组文库中钓取目的基因 Bm人 HindIll 1981年Ish- Horowics cos 和 Burke设计的特殊的 sal i 基因组克隆方案,选用 MbSw3A进行基因 组DNA的酶切。不仅是 HindIlL Sali Sau 3a 磷酸化酶 磷酸化酶 因为它们是4碱基识别 Sali bamBi Hindl BamHlI 位点的酶,而且它们和 BmmH是同尾酶。 BamBi BamBi Sal i HindIIIl 32-47kb
2、从基因组文库中钓取目的基因 1981年Ish-Horowics 和Burke设计的特殊的 基因组克隆方案，选用 MboI或Sau3A进行基因 组DNA的酶切。不仅是 因为它们是4碱基识别 位点的酶，而且它们和 BamHI是同尾酶。 cos BamHI HindIII Sal I HindIII Sal I 磷酸化酶 Sal I BamHI HindIII BamHI BamHI BamHI Sal I HindIII Sau 3A 磷酸 化酶 32-47 kb