蒸汽发生器包括电炉及一个12L容积的烧瓶（图中1,2）。蒸汽发生器借橡皮管与反 应管相连，反应管有，酒 （图中5》，样品和碱液可由此加入到反 Y军 图中4 生的氨可 以免仪器 吸收瓶（图中6）中。安装时各连接 2.样品处理： 某一固体样品中的含氮量是用100g该物质（干重）中所含氮的克数来表示(%)。因此 在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离 的水，都不能在100C以下烘干。 感在称量拖独交量磨细的样品一然厅汽玉误5的烘箱许小 次，直到两次称量数值不变，即达恒重 。每干 若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取0.1g左右的干燥面粉作为实验的样品。 3.消化： 取四个100mL凯氏烧瓶并标号 及4号瓶中各加Q.1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以 测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加完后，将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放 适当加强火力， 消化 消化完毕，等 混匀备用 4.迷馏： (1)蒸馏器的洗涤：在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水，加浓硫酸数滴及毛 细管或玻珠若干，关闭甲乙，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。并检查有无 漏气，5分钟后，打开活塞乙，使蒸汽洗涤漏斗5分钟，复将乙关闭，继续蒸馏的5分钟， 然后在冷器卜端 个盛有5毫升2%硼酸溶液和1一2滴指示剂 混合液的锥形瓶。 在液体中，实燕气流涂 狂形瓶 内的 动 约1厘 移去围 于蒸汽发生器内蒸气冷缩，压力诚低
蒸汽发生器包括电炉及一个 1~2 L 容积的烧瓶（图中 1，2）。蒸汽发生器借橡皮管与反 应管相连，反应管上端有一个小漏斗（图中 5），样品和碱液可由此加入到反应室（图中 4）， 反应室中心有一长玻璃管，与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可通 过反应室上安全管（图中 8）及冷凝器（图中 7）通过吸收瓶（图中 6）中。安装时各连接 处不能漏气，且安装好的不可轻易移动，以免仪器损坏。 2．样品处理： 某一固体样品中的含氮量是用 100g 该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。因此 在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用 105℃，因为非游离 的水，都不能在 100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于 105℃的烘箱内干燥 4 小时。用坩埚钳将 称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称量，按上述操作继续烘干样品。每干燥 1 小时后，称 重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取 0.1g 左右的干燥面粉作为实验的样品。 3．消化： 取四个 100mL 凯氏烧瓶并标号。各加 1 颗玻璃珠，在 1 及 2 号瓶中各加样品 0.1g，催 化剂 200mg，浓硫酸 5mL，注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在 3 及 4 号瓶中各加 0.1 毫升蒸馏水和与 1 及 2 号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以 测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加完后，将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放 出 SO2 白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止①。消化完毕，等 烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水 10mL（注意慢加，随加随摇）。冷却后将瓶中内容物倾入 50mL 的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用②。 4．蒸馏： （1）蒸馏器的洗涤：在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水，加浓硫酸数滴及毛 细管或玻珠若干，关闭甲乙，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。并检查有无 漏气，5 分钟后，打开活塞乙，使蒸汽洗涤漏斗 5 分钟，复将乙关闭，继续蒸馏约 5 分钟， 然后在冷凝器下端放一个盛有 5 毫升 2%硼酸溶液和 1—2 滴指示剂混合液的锥形瓶。位置 倾斜如图，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤 1—2 分钟，观察锥形瓶内的溶 液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开 冷凝管口约 1 厘米，继续通蒸汽 1 分钟，最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉，由 于蒸汽发生器内蒸气冷缩，压力减低，反应室内的水可自动吸出进入废液管中（图中 3）
打开甲，将废液排出。 关掉电炉，打开活塞甲、乙，再将事先准备好的盛有5L2%明酸及指示剂的锥形瓶放 在冷凝管中下，使管口浸入液面以下。 用吸管取10mL消化液，细心地由小漏斗处注入反应室，用2一3mL蒸馏水洗涤小漏斗 待消化液全部进入】 又应至 后关闭洁基甲。然后再 小漏斗处加30%NaOH10mL(用小量简 内仍 发生 内 色时再续 将角烧瓶下降，使冷凝管离开液面约1 1公 用少量蒸馏水冲洗冷凝管 口，洗液直接流入维开瓶内，然后，先移去锥形瓶，关掉电炉， 使反应室内废液倒吸进入废 液管内，打开甲而放出。整个蒸馏装置立即洗涤（包括水洗及蒸汽洗）备用。 待洋品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时讲行滴定。 五、结果与讨论： 1.计算： 总氯量=c-)×0.014×100 消化液总量(m) 测定时消化液用mX% 一定用去的箱的演流平均老升玫 定样品用去的盐酸溶液平均亮升 W:样品重量(g)。 14:氮的原子量： 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则， 样品中蛋白质含量(%)=总氮量×6.2 若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氨物质，叫需向样品中加入三氧乙酸。然后测定末 加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氨量，得出非蛋白氨及总氨量，从而 计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮一非蛋白氮 蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25 2.写出实验中应注意的主要事项。 3.指出该法测定蛋白质含量的局限性 注：①并非所有样品消化液透明时消化作用即已完成。另外消化液的颜色亦常因样品成分的不同而异 全部变成无机氮。以后即以此 ②本实验可分两次完成，第一次进行消化，第二次进行蒸偏。 思考题 1.指出下列试剂的作用 化时使用浓 硫酸姆及确液及指示剂 2.指出本测定方法 生误差的原因 3.写出下述各步反应式：①蛋白质消化：②氨的蒸馏：③氨的滴定
打开甲，将废液排出。 （2）蒸馏：取 50mL 锥形瓶数个，各加 5mL 硼酸和 1—2 滴指示剂，溶液呈紫红色， 用表面皿覆盖备用。 关掉电炉，打开活塞甲、乙，再将事先准备好的盛有 5mL2%硼酸及指示剂的锥形瓶放 在冷凝管中下，使管口浸入液面以下。 用吸管取 10mL 消化液，细心地由小漏斗处注入反应室，用 2—3mL 蒸馏水洗涤小漏斗， 待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加 30%NaOH 10mL（用小量筒 量取），让 NaOH 缓缓流入反应室，当小漏斗内仍有少量 NaOH 时，即关闭乙，再用约 3mL 蒸馏水于小漏斗内，同样放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封，关闭乙，立即加热蒸汽 发生器，并使沸腾，开始蒸馏。待三角烧瓶中液体由紫红色变成蓝绿色时再继续蒸馏 3 分钟， 将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约 1cm，继续蒸 1 分钟，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下 口，洗液直接流入锥开瓶内，然后，先移去锥形瓶，关掉电炉，使反应室内废液倒吸进入废 液管内，打开甲而放出。整个蒸馏装置立即洗涤（包括水洗及蒸汽洗）备用。 待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。 （3）滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示 溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。 五、结果与讨论： 1．计算： 总氮量= W c(V1 −V2 )0.014100 × ( ) (ml) ml 测定时消化液用量 消化液总量 ×% C：标准盐酸溶液摩尔浓度。 V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。 V2：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。 W：样品重量（g）。 14：氮的原子量。 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则， 样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25 若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未 加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而 计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮—非蛋白氮 蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25 2．写出实验中应注意的主要事项。 3．指出该法测定蛋白质含量的局限性。 注：①并非所有样品消化液透明时消化作用即已完成。另外消化液的颜色亦常因样品成分的不同而异 因此，每测一新样品时，最好先试验一下需多少时间才能使样品中的有机氮全部变成无机氮。以后即以此 时间为标准。本实验至消化液呈透明淡绿色时即消化完全，约需 2—3 小时。 ②本实验可分两次完成，第一次进行消化，第二次进行蒸馏。 思 考 题 1．指出下列试剂的作用 ①消化时使用浓硫酸、硫酸钾及硫酸酮粉末。 ②蒸馏与滴定中的 30%NaOH、2%硼酸溶液及指示剂。 2．指出本测定方法产生误差的原因。 3．写出下述各步反应式：①蛋白质消化；②氨的蒸馏；③氨的滴定
3.7Fo1in一酚法测定蛋白含量 一、目的： 1.学习Folin-一酚法测定蛋白质含量的原理及方法。 2.制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。 二、原理： 蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫 外吸收等测定得知：另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应 Foli一酚试剂法(Lowry法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根 据实验要求及实验室 条件进行选择。目前实验室多用Folin 一盼法测定蛋白质含量，此法留 优点是操作简单 速 灵敏度 ,较紫外吸 法灵10 此法是在Foi一酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如 CO一NH,一CH,一NH,一CS一NH以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲 剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化物均可干扰Fo一酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若 含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右）、(0. 左右)、硫酸钠 硝酸钠(1%入、 70 (5%)入、丙 对显色无 则需做 体双子指，这汤 Fo一酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、疏酸铜及酒石酸 钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸 的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸、色氨 酸含量。 本法可测定范围是25一250g蛋白质 三、试剂及器材： 1、试剂： ①标准蛋白质溶液 ②Folin-一酚试剂 试剂A: (1)4%碳酸钠溶液 (2)0.2mol/L氧氧化钠溶液 (3)1%硫酸铜溶液 (4)2%酒石酸钾钠溶液 临用前将(1)与(2)等体积配制碳酸钠 氢氧化钠溶液。(3) 与(4)等体积配合成 酒石酸钾钠溶液。 然后这两种试剂按50：1的比例配合，即成Fo一盼试剂A 试剂B:
3.7 Folin—酚法测定蛋白含量 一、目的： 1．学习 Folin—酚法测定蛋白质含量的原理及方法。 2．制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。 二、原理： 蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫 外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脲反应、 Folin—酚试剂法(Lowry 法)。这两类方法各有优缺点，选用何种方法测定蛋白质含量，可根 据实验要求及实验室条件进行选择。目前实验室多用 Folin—酚法测定蛋白质含量，此法的 优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏 10—20 倍，较 双缩脲法灵敏 100 倍，反应 15min 内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反 应受多种因素干扰。在测试时应排除干扰因素或做空白试验消除。 此法是在 Folin—酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如 —CO—NH2，—CH2—NH2，—CS—NH2 以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如 Tris 缓冲 剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化物均可干扰 Folin—酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若 含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约 0.5%左右）、胍（0.5% 左右）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮 （0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的 样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提 高碳酸钠—氢氧化钠的浓度 1—2 倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。 Folin—酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸 钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸 的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸、色氨 酸含量。 本法可测定范围是 25—250μg 蛋白质。 三、试剂及器材： 1、试剂： ①标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制 成 150μg/mL 蛋白溶液。 ②Folin—酚试剂 试剂 A： （1）4%碳酸钠溶液 （2）0.2mol/L 氢氧化钠溶液 （3）1%硫酸铜溶液 （4）2%酒石酸钾钠溶液 临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配合成 硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按 50∶1 的比例配合，即成 Folin—酚试剂 A。 此试剂临用前配制，一天内有效。 试剂 B：
称钨酸钠(NaWO4·2HO)100g、钼酸钠(Na:MoO:.·2HO)25g置2000mL磨口回 习，使其溶解。小火 10 3贮存液，此 为鲜黄色 不带任 由 可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢 复原色仍可继续使用。 试剂B贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液(1moL左右，以 酚肽为指示剂， 当溶液颜色由红一紫红一紫灰一墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为 2molL左右，将之稀释至相当于1moL酸度应用。 ③测试样品 血清，使用前稀释100倍。 2.器材 ①试管及试管架，②0.5mL,1mL及5mL吸量管，③恒温水浴锅，④722型分光光度计。 四、操作步骤： 1.制备Folin-一酚法标淮曲线 取14支试管，分两组按下表平行操作 试管 试剂处理 编 号 6 7 标准蛋白溶液mL 00.10.2040.60.81.0 蒸馏水mL 1.00.90.80.604☐020 Folin-一酚甲试剂/ml 50505.050☐505.050 混匀，于20-25℃放置10mim Fain一粉乙试剂mL 050.50505050505 迅速混匀，于30℃（或室温20一25℃）水浴保温30min,以蒸馏水为空白，在640*nm处比色 A60 *由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区， 2.测定示知样品蛋白质浓度 取4支试管，分2组，按下表平行操作。 空白管 试剂处理 样品管 ×2 ×2 血清稀释液ml 0.0 02 蒸馏水mL 10 08 下oin一酚甲试剂mL 5.0 50 混匀，于20-25℃放置10mi Folin-一酚乙试剂mL 0.5 0.5 迅速混匀.于30℃（或室温20一25℃）水浴保温30mim.以蒸馏水为空白，在640mm处比色
称钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g 置 2000mL 磨口回 流装置内，加蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 和浓盐酸 100mL。充分混匀，使其溶解。小火 加热，回流 10 小时（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂(Li2SO4)150g， 蒸馏水 50mL 及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴。冷却后定容至 1000mL，过滤即成 Folin—酚试剂 B 贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕色瓶中， 可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢 复原色仍可继续使用。 试剂 B 贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L 左右），以 酚肽为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为 2mol/L 左右，将之稀释至相当于 1mo/L 酸度应用。 ③测试样品 血清，使用前稀释 100 倍。 2．器材 ①试管及试管架，②0.5mL，1mL 及 5mL 吸量管，③恒温水浴锅，④722 型分光光度计。 四、操作步骤： 1．制备 Folin—酚法标准曲线 取 14 支试管，分两组按下表平行操作。 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液/mL 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Folin—酚甲试剂/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，于 20—25℃放置 10min Folin—酚乙试剂/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 迅速混匀，于 30℃（或室温 20—25℃）水浴保温 30min，以蒸馏水为空白，在 640*nm 处比色 A640 * 由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红光区呈现较宽吸收峰区，不同书籍选用不同的波 长，有选用 500 或 540nm，有选用 660，700 或 750nm.。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收。本实验 选用波长 640nm。 绘制标准曲线：以 A640 值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲 线。 2．测定示知样品蛋白质浓度 取 4 支试管，分 2 组，按下表平行操作。 空 白 管 ×2 样 品 管 ×2 血清稀释液/mL 0.0 0.2 蒸馏水/mL 1.0 0.8 Folin—酚甲试剂/mL 5.0 5.0 混匀，于 20—25℃放置 10min Folin—酚乙试剂/mL 0.5 0.5 迅速混匀，于 30℃（或室温 20—25℃）水浴保温 30min，以蒸馏水为空白，在 640nm 处比色 A640 试 管 编 号 试 剂 处 理 试 管 编 组 试 剂 处 理
五、结果与讨论： 1.绘制标准曲线 2.计算： 蛋白质含量(g100mL血清) ,人值对应标准曲线蛋白质含量gx10 测定时用稀释血清的ml数 -×血清稀释倍数×100 注意事项 (1)Folin-一酚乙试剂在酸性条件下稳定，而Folin-一酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质 作用生成碱性的铜一蛋白质溶液。当Foim一酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管）， 使还原反应产生在磷钼酸一磷钨酸试剂被破坏之前。 (2)血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清 酌情稀释 思考题 1.Foln一酚测定蛋白的原理是什么？
五、结果与讨论： 1．绘制标准曲线 2．计算： 蛋白质含量（g/100mL 血清） = ( ) 测定时用稀释血清的 数 值对应标准曲线蛋白质含量 ml A g 6 640 10 − ×血清稀释倍数×100 注 意 事 项 （1）Folin—酚乙试剂在酸性条件下稳定，而 Folin—酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质 作用生成碱性的铜—蛋白质溶液。当 Folin—酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇—管）， 使还原反应产生在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前。 （2）血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清 酌情稀释。 思 考 题 1．Folin—酚测定蛋白的原理是什么？ 2．有哪些因素可干扰 Folin—酚测定蛋白含量？ 3．作为标准蛋白的牛血清清蛋白或酪蛋白在应用时有何要求？