义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。即： 式中：u为泳动度(cm2,V·min)(厘米2·伏特分)： v为质点的泳动速度(cm·s或cm·min)(厘米·秒或分)： E为电场强度(V·cm)(伏特·厘米1)： d为质点泳动距离(cm)(厘米)： 1为支持物的有效长度(cm)(厘米)： V为加在支持物两端的实际电压(V)(伏特)： 为币电时间s或min)(秒或分) 通过测量d、人、人、1便可计算出质点的泳动度。 泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状 一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越 快：反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液 的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种： (一)电场强度（电势梯度） 它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的 如电压降为200V,则电场强度为200V20 由 强度越高，带电质点移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压(1O0500V 电泳和高压(500-10000V)电泳。常压电泳的电场强度一般为2~10V·cm',电泳分离时 间较长，需要几小时至几天：高压电泳的电场强度为20-200Vcm',电泳分离时间较短， 有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸 小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设 可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距 也可达到高压快速的目的。如将原来两端 相距冰速度的滤纸政为5m，外加电压仍为0心.电场强度则变为4O~cm 这样就加 (二)溶液的pH值 溶液的pH值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质， 氨基酸等两性电解质而言，pH值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快： 深狮液电有的量左异纹大，以利于分高，为了使电冰过程中清减的数价定，使色究用 反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的p州值，使各种蛋白 (三)溶液的高子强度 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离 电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢： 离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。 在稀溶液中 离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘 积相加，以2除其和。计算公式如下： 子强度①工☑ 式中：C为离子的摩尔浓度(molL) Z为离子的价数。 例如：求0.015mol/LNaSO溶液的离子强度，则：
义是带电质点在单位电场强度下的泳动速度。即： u= E v = V l d t / / = Vt dl （cm2·V-1·s -1）(厘米 2·伏特-1·秒-1 ) 式中：u 为泳动度（cm2·V-1·min-1）（厘米 2·伏特-1 分-1）； v 为质点的泳动速度（cm·s -1 或 cm·min-1）（厘米·秒-1 或分-1）； E 为电场强度（V·cm-1）（伏特·厘米-1）； d 为质点泳动距离（cm）（厘米）； l 为支持物的有效长度（cm）（厘米）； V 为加在支持物两端的实际电压（V）（伏特）； t 为通电时间（s 或 min）（秒或分）。 通过测量 d、l、V、t 便可计算出质点的泳动度。 泳动度首先取决于带电质点的性质，即质点所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。 一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越 快；反之，则越慢。泳动度除受质点本身性质的影响外，还受其他外界因素的影响，如溶液 的粘度等。影响泳动速度的主要外界因素还有下列几种： （一）电场强度（电势梯度） 电场强度是指每 cm 的电压降，它对泳动速度起着十分重要的作用。例如，纸上电泳的 支持物滤纸两端相距 20cm，如电压降为 200V，则电场强度为 200V/20cm=10V·cm-1。电场 强度越高，带电质点移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（100~500V） 电泳和高压（500~10 000V）电泳。常压电泳的电场强度一般为 2~10V·cm-1，电泳分离时 间较长，需要几小时至几天；高压电泳的电场强度为 20~200V·cm-1，电泳分离时间较短， 有时仅需几分钟。常压电泳多用于分离蛋白质等大分子物质，而高压电泳则用来分离氨基酸、 小肽、核苷酸等小分子物质。在生产中有时需要进行快速的中间分析，如果没有高压电泳设 备，可以把常压电泳小型化，缩短滤纸两端距离，也可达到高压快速的目的。如将原来两端 相距 20cm 的滤纸改为 5cm，外加电压仍为 200V，电场强度则变为 40V·cm-1，这样就加快 了电泳速度。 （二）溶液的 pH 值 溶液的 pH 值决定带电质点解离的程度，也决定物质质点所带净电荷的多少。对蛋白质、 氨基酸等两性电解质而言，pH 值距等电点越远，质点所带净电荷越多，泳动速度也越快； 反之，则越慢。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适的 pH 值，使各种蛋白 质所带净电荷的量差异较大，以利于分离。为了使电泳过程中溶液的 pH 值恒定，必须采用 缓冲溶液。 （三）溶液的离子强度 离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子 电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢； 离子强度越低，质点泳动的速度越快。一般最适合的离子强度在 0.02~0.2 之间。 在稀溶液中，离子强度的计算方法，是将每一离子浓度乘以其价数的平方，再将所有乘 积相加，以 2 除其和。计算公式如下： 离子强度（I）= 2 1 ∑CZ 2 式中：C 为离子的摩尔浓度（mol/L）； Z 为离子的价数。 例如：求 0.015mol/LNa2SO4 溶液的离子强度，则：
离子强度(D=号(0015×2x×12+0015×2)0045 (四)电渗现象 体在电场中对 个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由 向负 有负电荷，而与 的水溶液 为静电感 则质 物的作用下溶液 速度和由 向正 电渗速 避免使用具有高电渗作用的支持物。 酷酸纤维薄膜电泳是用酷酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 品透性，罪薄膜由三乙酸纤维素制成：它具的支基物进行蛋白电泳有简电议微米：有 强渗透 分离清 附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、 血红蛋白和同功的分离及用在免疫电泳中。 三、器材及试剂： 1.器材： ①醋酸纤维薄膜(2×8cm ⑥玻璃板 ②常压电泳仪 ⑦竹镊 ③点样器（盖玻片） ⑧白磁反应板 ④培养皿（染色及漂洗用） ⑨人血清或鸡血清 ⑤粗滤纸 2.试剂 ①巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07)：巴比妥2.76g,巴比妥纳15.45g,加水至 1000mL. ②染色液：含氨基黑10B0.25g,甲醇50mL,冰酷酸10mL,水40mL(可重复使用) ③漂洗液：含甲醇或乙醇45mL,冰醋酸5mL,水50mL。 ④透明液：含无水乙醇7份，冰酷酸3份 四、操作步骤： 1,浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做 上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟 2,点样：把膜条从缓中液中取出，夹在两层粗波纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻 璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2一3m 处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。 样品 ,将膜条平悬于电泳槽 加 的一端与支架的前沿对齐，而另 除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥 梁”。)膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V,电流强度0.4 一0.7mA/cm膜宽，电泳时间钓为60分钟
离子强度（I）= 2 1 （0.015×2×1 2＋0.015×2 2）=0.045 （四）电渗现象 液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由 于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便 向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移 动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。若质点原来向负极移动，则其表面速度比 电泳速度快。若质点原来向正极移动，则其表面速度比电泳速度慢。因此，在电泳时应尽量 避免使用具有高电渗作用的支持物。 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅 120 微米，有 强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用 量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、 血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。 三、器材及试剂： 1．器材： ①醋酸纤维薄膜（2×8cm） ⑥玻璃板 ②常压电泳仪 ⑦竹镊 ③点样器（盖玻片） ⑧白磁反应板 ④培养皿（染色及漂洗用） ⑨人血清或鸡血清 ⑤粗滤纸 2．试剂： ①巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度 0.07）：巴比妥 2.76g，巴比妥纳 15.45g，加水至 1000mL。 ②染色液：含氨基黑 10B0.25g，甲醇 50mL，冰醋酸 10 mL，水 40 mL（可重复使用）。 ③漂洗液：含甲醇或乙醇 45 mL，冰醋酸 5mL，水 50mL。 ④透明液：含无水乙醇 7 份，冰醋酸 3 份。 四、操作步骤： 1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜 1 张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做 上记号）放在缓冲液中浸泡 20 分钟。 2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻 璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端 2—3cm 处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。 3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽 支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它 的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱 除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥 梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至 160V，电流强度 0.4 —0.7mA/cm 膜宽，电泳时间约为 60 分钟。 + 膜条 样品
4.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。 6.定量：有两种方法 (1)将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于 4.0ml0.4mol·LNa0H溶液中(37℃)5一10分钟，色泽浸出后，比色(590nm)。设各部 分的光密度分别为：ODODa1ODa2、ODB、ODY。则光密度总和(OD卷)为： OD =OD a+ODa:+ODa:+OD,+OD 白蛋白% 0D鱼×100 a1球蛋白%-ODL×10m ODe ODe :球蛋白%-OD×10 B球蛋白% ODs 0D2x100 ODs Y球蛋白-D×100 OD (2)把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约5一10分 用本法测得血清蛋白各组分的正常值为： 白蛋白=67.24%(61.2-74.5%) a1球蛋白+42球蛋白+B球蛋白=16.92%(11.2-22%) Y球蛋白=15.84%(10.4-20.6%) 思考题 1.点样端为何放在负极？ 2,实验中应注意哪些事项？ 3.醋酸纤维素薄膜用作电泳支持物有何优点
4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡 10 分钟。 5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可 得色带清晰的电泳图谱。 6．定量：有两种方法 （ 1 ） 将 上 述 漂 净 的 薄 膜 用 滤 纸 吸 干 ， 剪 下 各 种 蛋 白 质 色 带 ， 分 别 浸 于 4.0ml0.4mol·L -1NaOH 溶液中（37℃）5—10 分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部 分的光密度分别为：OD 白、ODα1、ODα2、ODβ、ODγ。则光密度总和（OD 总）为： OD 总=OD 白+ODα1+ODα2+ODβ+ODγ 白蛋白%= 总 白 OD OD ×100 α1 球蛋白%= OD总 OD1 ×100 α2 球蛋白%= OD总 OD 2 ×100 β球蛋白%= OD总 OD ×100 γ球蛋白%= OD总 OD ×100 （2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后 ．．．．．．．．，浸入透明液中约 5—10 分 钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱， 可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。 用本法测得血清蛋白各组分的正常值为： 白蛋白=67.24%（61.2—74.5%） α1 球蛋白+α2 球蛋白+β球蛋白=16.92%（11.2—22%） γ球蛋白=15.84%（10.4—20.6%） 思 考 题 1．点样端为何放在负极？ 2．实验中应注意哪些事项？ 3．醋酸纤维素薄膜用作电泳支持物有何优点？
3.5牛奶中酪蛋白和乳糖的提取 一、目的：学习从牛乳中制备酪蛋白和乳糖的原理和方法，加深对等电点概念的印象。 二、原理：牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/儿。酪蛋白是以酪蛋白酸钙 磷酸钙 合体胶粒存在，胶粒直径 凝乳酶的作用下 白会沉 得干鲜 白的 7时酪蛋 用乙醇、乙醒 混合物、 蛋 来洗涤的 去除醇 蛋白和乳球蛋白， 中 结品制取乳糖。 三、实验器材试剂： 离心机、抽滤装置、精密pH47试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、玻璃棒、三角瓶、 量筒 脱脂乳或脱脂奶粉：乙醚：95%乙醇：无水乙醚 02m0l/LDH47醋酸.酷酸钠中溶液：乙醇.乙继混合液=1：1(VV) 四、操作步骤 1.从牛奶中分离酪蛋白 将40mL牛奶加热至40℃，在搅拌下慢慢加入预热至在烧杯中加入40℃，pH4.7的醋 酸缓冲液40mL,用精密p4,7试纸或酸度计调p至47。 将上述悬浮液冷至室温。3000pm离心15分钟，收集清液留做分离乳糖，沉淀为酪蛋 白粗制品。 用水洗沉淀2次，每次洗后3000rpm离心10分钟，弃去清液。 将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。 准确称重，计算含量和得率。 2.从牛奶中分离乳糖 在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g 日的 方面是中和溶液的 一方面又能使乳白蛋白沉淀。过 除去沉淀，在滤液中加入12粒沸石，加热浓缩至35mL,加入10m959%乙醇（注意离 开火焰)和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞 放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。 3.乳糖成脎试验 取自制乳糖溶于 >量水中，浓度约为5% 在试管中加 1mL乳糖溶流 1mL苯肼试 放置冷却，乳成结品析出 思考题：制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
3.5 牛奶中酪蛋白和乳糖的提取 一、目的：学习从牛乳中制备酪蛋白和乳糖的原理和方法，加深对等电点概念的印象。 二、原理：牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为 35g / L。酪蛋白是以酪蛋白酸钙—— 磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为 20～800nm，平均为 100nm。在酸或凝乳酶的作用下 酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白的等电点 pI= 4.7 时，酪蛋白沉淀。用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物，以去除醇溶性和脂溶 性杂质，就可得到较纯的酪蛋白。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有 乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的 99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、 结晶制取乳糖。 三、实验器材试剂： 离心机、抽滤装置、精密 pH4.7 试纸、恒温水浴锅、烧杯、温度计、玻璃棒、三角瓶、 量筒。 脱脂乳或脱脂奶粉；乙醚；95%乙醇；无水乙醚； 0.2mol/LpH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲溶液；乙醇-乙醚混合液=1:1（V/V） 四、操作步骤 1. 从牛奶中分离酪蛋白 将 40mL 牛奶加热至 40℃，在搅拌下慢慢加入预热至在烧杯中加入 40℃，pH4.7 的醋 酸缓冲液 40mL，用精密 pH4.7 试纸或酸度计调 pH 至 4.7。 将上述悬浮液冷至室温。3000rpm 离心 15 分钟，收集清液留做分离乳糖，沉淀为酪蛋 白粗制品。 用水洗沉淀 2 次，每次洗后 3000rpm 离心 10 分钟，弃去清液。 在沉淀中加入少量 10mL 乙醇，搅拌，将悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚 混合液洗沉淀 2 次。最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。 将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。 准确称重，计算含量和得率。 2. 从牛奶中分离乳糖 在除去酪蛋白的乳清中，加入 1.5gCaCO3 粉末，搅拌均匀后加热至沸腾。加 CaCO3 的 目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另一方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤 除去沉淀，在滤液中加入 1～2 粒沸石，加热浓缩至 3～5mL，加入 10 mL95%乙醇（注意离 开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞 放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用 95%乙醇洗涤产品。 3. 乳糖成脎试验 取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为 5%，在试管中加入 1mL 乳糖溶液，1mL 苯肼试 剂，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热 10～15 分钟后，取出 放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形状，可证实为乳糖。 思考题：制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
3.6总氮量的测定一凯氏(Micro-Kjeldahl)定氮法 一、目的： 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。 二、原理： 常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转 变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称之为“消化”。 CH:NH:COOH+3H2SO.-2CO:+3SO:+4H:O+NHs 2NH+H2SO4→(NH)2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一 浓度的现来空 无，然后用标准无机酸滴定，直到 三、器材及试剂： 1.器材： ①凯氏烧瓶 ⑥烘箱 ②凯氏定氨蒸馏装置 ⑦电炉 ③50mL容量瓶 ⑧1000mL蒸馏烧瓶 ④微量滴定管 ⑨小玻璃珠或毛细管 ⑤分析天平 ⑩市售标准面粉或富强粉 2.试剂： 氢氧化钠溶液 K2SO4与CuSO4·5H20以3：1配比研磨混合 ⑤标准盐酸溶液（约0.01mol/L) ⑥混合指示剂（田氏指示剂） 由50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备 用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 四、操作步骤： 1.凯氏定氨仪的构造和安装： 凯氏定氨仪主要由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成。见图6-1：
3.6 总氮量的测定—凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法 一、目的： 学习凯氏定氮法的原理和操作技术。 二、原理： 常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转 变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称之为“消化”。 但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点， 并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下： CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3 2NH3+H2SO4→（NH4）2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定 浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到 恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔 数）计算出待测物中的总氮量。 三、器材及试剂： 1．器材： ①凯氏烧瓶 ⑥烘箱 ②凯氏定氮蒸馏装置 ⑦电炉 ③50mL 容量瓶 ⑧1000mL 蒸馏烧瓶 ④微量滴定管 ⑨小玻璃珠或毛细管 ⑤分析天平 ⑩市售标准面粉或富强粉 2．试剂： ①浓硫酸（化学纯） ②粉末硫酸钾-硫酸铜混合物 K2SO4 与 CuSO4·5H2O 以 3：1 配比研磨混合 ③30%氢氧化钠溶液 ④2%硼酸溶液 ⑤标准盐酸溶液（约 0.01mol/L） ⑥混合指示剂（田氏指示剂） 由 50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与 200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备 用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。 四、操作步骤： 1．凯氏定氮仪的构造和安装： 凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成。见图 6-1：