第一章糖类 1.1蒽酮比色法测定总糖 一、目的：学习慈酮比色法测定总糖的原理。 葸酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存有含较多色氨酸的蛋 白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特定的糖类，反应较稳定。 木法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。 三、实验材料和仪器 无蛋白滤液或其他生物材料。 吸管5ml(×1lmL(×2)、0.5mL(×2)0.2mL(×1)0.1mL(×1) 试管1.5×15cm(×7). 721型（或722型）分光光度计。 水浴锅 冰浴银 试剂 1.蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000mL80%()硫酸中，当日配制使用。 3.标准糖原溶液(0memL):100mg糖原，用蒸馏水定容至1000mL(可滴加几滴甲米 作防腐剂)。 四、操作 1.制作标准曲线：取干试管6支，按下表操作： 步 1 2 3 45 标准糖溶液(mL) 0 010030405 蒸馏水 10.90.8070.60.5 置冰水浴中5分钟 随酮试剂 沸水浴中准确煮沸10分钟，自来水冷却，室温放置10分钟，比色 2.样品含糖量测定 吸取 浸于冰浴中冷却，再加入 ml 1mL无蛋白糖类溶液 相同，测的光密度值由标准曲线查 出 ▣巴 做标 生曲 品液的糖含量。 3.计算：糖含量%=100×A×CW A:为样品稀释后的体积。 C:为标准曲线查出的糖含量mg/ml W:为样品的质量
第一章 糖类 1.1 蒽酮比色法测定总糖 一、目的：学习蒽酮比色法测定总糖的原理。 二、原理：蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己 糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在 620nm 处有最大吸收。 蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存有含较多色氨酸的蛋 白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特定的糖类，反应较稳定。 木法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。 三、实验材料和仪器 无蛋白滤液或其他生物材料。 吸管 5m1（×1）、lmL（×2）、0.5 mL（×2）、0.2mL（×1）、0.1mL（×1） 试管 1.5×15cm（×7）。 721 型（或 722 型）分光光度计。 水浴锅 冰浴锅 试剂 1．蒽酮试剂：取 2g 蒽酮溶于 1 000 mL 80％（V/V）硫酸中，当日配制使用。 2．标准葡萄糖溶液（0.lmg/mL）：100mg 葡萄糖用蒸馏水定容至 1000m1(可滴加几滴甲 苯作防腐剂)。 3.标准糖原溶液(0.lmg/mL)：100mg 糖原，用蒸馏水定容至 1 000mL（可滴加几滴甲苯 作防腐剂）。 四、操作 1． 制作标准曲线：取干试管 6 支，按下表操作： 步骤 管号 0 1 2 3 4 5 标准糖溶液(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 蒸馏水 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 置冰水浴中 5 分钟 蒽酮试剂 4 4 4 4 4 4 沸水浴中准确煮沸 10 分钟，自来水冷却，室温放置 10 分钟，比色 O.D620nm 2. 样品含糖量测定：吸取 1 mL 无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入 4 mL 蒽酮试剂，沸水浴中煮沸 10 分钟，取出后自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线 相同，测得的光密度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。 3．计算：糖含量％＝100×A×C/W A：为样品稀释后的体积。 C：为标准曲线查出的糖含量 mg／mL. W：为样品的质量
1.2还原糖和总糖的测定—一3,5-二硝基水杨酸比色法 一、目的 原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光 二、原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖 都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还 原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还 原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中 还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5二硝基水杨酸则被还原为棕红 色的3-氨基5-硝基水杨酸。 在 定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关 系，利用分光光度计，在540m波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样 品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所 以在计算多糖含量时应乘以0.9。 OH NO2 OH NH2 HOOC- +原塘 NO2 NO2 (DNS) (3-氨基-5-墓水杨酸)？ 三、实验材料、主要仪器和试剂 1.实验材料 小麦面粉：精密pH试纸。 2.主要仪器 (1)具塞玻璃刻度试管：20mL×11 (2)大离心管：50mL×2 (3)烧杯：100mX1 1mL×1:2mL×2:10mL×1 浴锅 （8)沸水溶 (9)离心机 (10)天平 (1)分光光度计 3.试剂 (1)1mgmL葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后， 转移到00：用意 定容至100mL,混匀，4℃冰箱中保存备用。 (2 DNS 5g亚硫酸钠，搅于 溶解 (3)碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。 (4)酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。 (5)6mol/LHC1和6 mol/L NaOH各100mL
1.2 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法 一、目的 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的 使用。 二、原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖 都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还 原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还 原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中 还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红 色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关 系，利用分光光度计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样 品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所 以在计算多糖含量时应乘以 0.9。 HOOC NO OH NO2 2 + 还原糖 NO OH NH2 2 (DNS) （3－氨基－5－硝基水 杨酸 ） ? HOOC 三、实验材料、主要仪器和试剂 1． 实验材料 小麦面粉；精密 pH 试纸。 2． 主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2 （3）烧杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）沸水浴 （9）离心机 （10）天平 （11）分光光度计 3． 试剂 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后， 转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 将 6.3g DNS 和 262mL 2mol/L NaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶 液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，贮于棕 色瓶中备用。 （3）碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100mL 蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250mL 70%乙醇中。 （5）6 mol/L HCl 和 6 mol/L NaOH 各 100mL
四、操作步骤 1。制作葡萄糖标准曲线 取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mgmL的葡萄糖标准液、蒸 馏水和3,5二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1萄萄糖标准由 线制作 管号1mg/mL.萄萄糖标准液(ml)蒸馏水(mL)DNS(mL)葡萄糖含量(mg)O.D.s40m 16 0.6 1.4 15 0.6 0.8 12 0.8 0.8 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min,取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL 加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540加m,用0号管调零点，测出1~6 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标 准曲线。 2.样品中还原糖和总糖的测定 (1)还原糖的提取 准确称取3O0g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50mL恭馏水，授匀，置于50℃恒温水浴中保温20mim,使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀】 转移到50mL离心管中，于4O00rmn下离心5mim,沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心 将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待 测液。 (2)总糖的水解和提取 ,加15mL蒸馏水及10mL6 mol/L HCI 元 中 中的水 定容后的水解液过滤，取滤液 容，混 匀，作为总糖待测液。 (3)显色和比色 取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可 使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表2祥品还原糖测定 管号 还原特测液 DNS 查曲线萄萄糖量 (OD: (me) 05 15 15 0.5 1.5 1.5 1.5 L10 五、结果与计算 .竹出 8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别 查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 提取液总体积 查曲线所得简萄糖毫克数× 还原塘(%) 测定时取用体积 -X100 样品毫克数 总糖(%)= 查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数 样品毫克数 ×0.9×100
四、操作步骤 1． 制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 20mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸 馏水和 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表 1 葡萄糖标准曲线制作 管号 1mg/mL 葡萄糖标准液（mL） 蒸馏水（mL） DNS（mL） 葡萄糖含量（mg） O.D.540nm 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至 20mL， 加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，测出 1~6 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标 准曲线。 2． 样品中还原糖和总糖的测定 （1）还原糖的提取 准确称取 3.00g 食用面粉，放入 100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 50mL 蒸馏水，搅匀，置于 50℃恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀） 转移到 50mL 离心管中，于 4 000r/min 下离心 5min，沉淀可用 20mL 蒸馏水洗一次，再离心， 将二次离心的上清液收集在 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待 测液。 （2）总糖的水解和提取 准确称取 1.00g 食用面粉，放入 100mL 三角瓶中，加 15mL 蒸馏水及 10mL 6mol/L HCl， 置沸水浴中加热水解 30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液 冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，用 6mol/LNaOH 中和至微红色，用蒸馏水定容在 100mL 容 量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液 10mL，移入另一 100mL 容量瓶中定容，混 匀，作为总糖待测液。 （3）显色和比色 取 4 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可 使用制作标准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表 2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液 （mL） 总糖待测液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD540nm） 查曲线葡萄糖量 （mg） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算： 计算出 7、8 号管光密度值的平均值和 9、10 管光密度值的平均值，在标准曲线上分别 查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 还原糖（%）= 查曲线所得葡萄糖毫克数× 提取液总体积 测定时取用体积 ×100 样品毫克数 总糖（%）= 查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数 ×0.9×100 样品毫克数
大、注意事项 L.离心时对称位置的离心管必须配平。 2.标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 3.面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。 七、思考题 1.3,5二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的？ 2.如何正确绘制和使用标准曲线？ 参考答案 1。植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的 浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件 酸及 对标准曲线 由于多糖水解为单糖时，每断裂 求出 个糖苷键需要加 一分子水，所 金量时应乘 以0.9. 2.标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm,标示出刻度和葡萄糖的 毫克数：纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm,标示刻度和光密度值：曲线为过原点的直线，测 定点均匀分布在直线的两侧：标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中 的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线：测定数据不应记在标准曲 线上
六、注意事项 1． 离心时对称位置的离心管必须配平。 2． 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 3． 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。 七、思考题 1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2．如何正确绘制和使用标准曲线? 参考答案 1．植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的 寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下 加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨 酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计， 在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘 以 0.9。 2．标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边 1.5~2cm，标示出刻度和葡萄糖的 毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边 1.5~2cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测 定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中 的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲 线上
1.3总糖和还原糖的测定一斐林氏法 总糖和还原糖测定方法较多，如3,5一二硝基水杨酸法、碱性铜试剂法、葱酮比色法、 斐林氏法等。这里只介绍斐林氏法。 一、目的 学习堂挥生产实践中常用的快速定糖方法 二、原理 还原糖在碱性溶液中能将Ag Hg C(CNs等金属离子还原 而糖本身则氧 进行 化 中血)。当甲乙两液 、 化钠 COONa COONa H-C-OH +C2*一 H-6O Cu +H:O H-C-OH H-CO 酒石酸络的()钾钠盐 酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐在与还原糖共热时，二价铜离子即被还原成一价的氧化亚铜红 色沉淀。 COONa H-CuCH-OH(CHOH)CHO H-C-0 和甸裙 Cook CH2OH(CHOH)4COOH Cu2O 葡萄糖酸 氧化亚铜 此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氯酸络铜(【)钾盐。 CuO+K4Fe(CN)6+3 H2O- K2CuzFe(CN)+2 KOH+2 H2O 亚铁氯化钾 亚铁氰酸络铜(1)钾盐 斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强，因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜 还原，只有当二价铜被还原完毕后，才能使次甲基蓝（甲烯蓝）还原为无色，测定中以此作 为滴定终点。 一对照管（不加样品），用标准葡萄糖滴定求 定体积斐林试 剂中二价 消耗斐林试剂中 二价铜 的量再用标 标准葡萄 量(B)。将(A)减去(B)就可求得样品中还原糖量。 三、器材及试剂： 1.器材： ①淀粉 ②广范试纸pH1~12。 ③吸管5毫升(×4)，10毫升(×2) ④容量瓶100毫升(×3) ⑤烧杯150毫升(×1)，100毫升(×1) ©三角烧瓶250毫升(×6) ⑦滴定管25毫升(×1) ®双孔橡皮寒
1.3 总糖和还原糖的测定——斐林氏法 总糖和还原糖测定方法较多，如 3，5—二硝基水杨酸法、碱性铜试剂法、蒽酮比色法、 斐林氏法等。这里只介绍斐林氏法。 一、目的 学习掌握生产实践中常用的快速定糖方法。 二、原理 还原糖在碱性溶液中能将 Ag +，Hg +，Cu 2+，Fe(CN)6 3-等金属离子还原，而糖本身则氧 化成各种羟酸，利用这一特性可以对还原糖进行定量测定。本实验采用斐林试剂热滴定法， 氧化剂是斐林试剂，它是由甲乙两种溶液组成，甲液中含有硫酸铜、次甲基蓝；乙液中含有 氢氧化钠、酒石酸钾钠和亚铁氰化钾（黄血盐）。当甲乙两液混合时，硫酸铜和氢氧化钠作 用形成氢氧化铜沉淀，由于溶液中存在酒石酸钾钠，它和氢氧化铜形成了可溶性络合物。 COONa COONa 酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐在与还原糖共热时，二价铜离子即被还原成一价的氧化亚铜红 色沉淀。 COONa 葡萄糖酸 氧化亚铜 此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐。 Cu2O + K4Fe(CN)6 + 3 H2O K2Cu2Fe(CN)6 + 2 KOH + 2 H2O 亚铁氰化钾 亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐 斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强，因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜 还原，只有当二价铜被还原完毕后，才能使次甲基蓝（甲烯蓝）还原为无色，测定中以此作 为滴定终点。 在测定时先做一对照管（不加样品），用标准葡萄糖滴定求知一定体积斐林试剂中二价 铜和次甲基蓝的量，即测定对照管消耗的标准葡萄糖量（A）。再做样品管，样品中还原糖 消耗斐林试剂中一部分二价铜，剩余的量再用标准葡萄糖来滴定，即样品消耗的标准葡萄糖 量（B）。将（A）减去（B）就可求得样品中还原糖量。 三、器材及试剂： 1．器材： ①淀粉 ②广范试纸 pH1～12。 ③吸管 5 毫升（×4），10 毫升（×2） ④容量瓶 100 毫升（×3） ⑤烧杯 150 毫升（×1），100 毫升（×1） ⑥三角烧瓶 250 毫升（×6） ⑦滴定管 25 毫升（×1） ⑧双孔橡皮塞 H—C—OH — — H——C—OH COOK + Cu 2+ — H——C—O H——C—O COOK Cu +H2O 酒石酸钾钠 酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐 — H—C—O H—C—O — — COOK Cu + CH2OH(CHOH)4CHO 葡萄糖 CH2OH(CHOH)4COOH + Cu2O↓