第八章吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法，可见分光 光度法(visible spectrophotometry)及紫外汁光光度法(。ltravi.)letspectrophotometry)等。 本章重点讨论可见分光光度法。 许多物质是有颜色的，如高锰酸御水溶液呈深紫色，C水溶液呈蓝色。这些物质愈浓， 颜色俞深。可以用比物领色的深战来测定物质的浓府，议种定方法就称为比色分析法。游 若近代测试仪器的发展，目前已普遍地使用分光光度计测量物质的吸光程度。应用分光光度 计的分析方法称为分光光度法 例如，含铁量为0.001%的试样，若用滴定法测定，称量1g试样，仅含铁0.01mg 用1.6幸10-mol.LKC0,标准溶液来滴定，仅需消耗0.02mL即达终点。一般滴定 管的读数误差为0.02L。显然，不能用滴定法测定上述试样中微量铁。但是如果将含 0.01mg铁的试样，在容量瓶中配成50mL溶液，在一定条件下，用1,10一邻二氮杂菲 显色，即生成橙红色的1,10一邻二氮杂菲亚铁配合物： 11 Fe2+3 1,10-邻二氮杂菲 橙红色 通常吸光光度法所测试液的浓度下限达10~10mol.L,具有较高的灵敏度，适用于 微量组分的测定。某些新技术如催化分光光度法，灵敏度更高可达~108ol.·L。 吸光光度法测定的相对误差约为2%~5%，可满足微量组分测定对准确度的要求。另 外，吸光光度法测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛，几乎所有的元机物质和许 多有机物质的微量成分都能用 此法进行测定。它还常用于化学平衡等的研究。因此吸光光度 法对生产或科学研究都有极其重要的意义。 §8一1吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生反射、散射、吸 酮式和烯醇式互变异构体亦因为前者无共轭体系而后者有共轭体系得以区别。 纯度检查如果某化合物在紫外光某区域没有吸收峰，而杂质有较强吸收，就可方便地 检出该化合物中痕量杂质。例如乙醇中有无杂质苯，只要观察在256m处有无茶的吸收即 可，因为苯在此有吸收而乙醇无吸收 主成分有吸收，而杂质无吸收，则可在主成分的入处测量吸收系数，并与理论值比 较来检查纯度。 收或透射.如图9一1所示。若被照射物系均匀溶液，则光的散射可以忽略 人眼能感觉到的光称为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜 色。当一束白光（由各种波长的光按一定比例组成）如 日光或白炽灯光等通过某一有色溶液时， 一些波长的光 界面反射损 被溶液吸收，另一些波长的光则透过。透射光（或反射 光)刺激人眼而使人感觉到颜色的存在。因此溶液的颜 一透射光宋 入射光束 面反射损失 图9-1溶液对光的作用示意图
第八章 吸光光度法 基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度法，包括比色法，可见分光 光度法（visible spectrophotometry）及紫外汁光光度法（。ltravi。）letspectrophotometry）等。 本章重点讨论可见分光光度法。 许多物质是有颜色的，如高锰酸钾水溶液呈深紫色，Cu2+水溶液呈蓝色。这些物质愈浓， 颜色愈深。可以用比较颜色的深浅来测定物质的浓度，这种测定方法就称为比色分析法。随 着近代测试仪器的发展，目前已普遍地使用分光光度计测量物质的吸光程度。应用分光光度 计的分析方法称为分光光度法。 例如，含铁量为 0．001％的试样，若用滴定法测定，称量 1g 试样，仅含铁 0．01 mg， 用 1．6 * 10－3mol． L -lK2Cr2O7，标准溶液来滴定，仅需消耗 0．02mL 即达终点。一般滴定 管的读数误差为 0．02 mL。显然，不能用滴定法测定上述试样中微量铁。但是如果将含 0．01mg 铁的试样，在容量瓶中配成 50 mL 溶液，在一定条件下，用 1，10 一邻二氮杂菲 显色，即生成橙红色的 1，10－邻二氮杂菲亚铁配合物： 通常吸光光度法所测试液的浓度下限达 10-5～10-6mol.L－l，具有较高的灵敏度，适用于 微量组分的测定。某些新技术如催化分光光度法，灵敏度更高可达～10-8mol.·L －1。 吸光光度法测定的相对误差约为 2％～5％，可满足微量组分测定对准确度的要求。另 外，吸光光度法测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛，几乎所有的元机物质和许 多有机物质的微量成分都能用此法进行测定。它还常用于化学平衡等的研究。因此吸光光度 法对生产或科学研究都有极其重要的意义。 §8—1 吸光光度法基本原理 物质对光的选择性吸收 当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，于是产生反射、散射、吸 酮式和烯醇式互变异构体亦因为前者无共轭体系而后者有共轭体系得以区别。 纯度检查 如果某化合物在紫外光某区域没有吸收峰，而杂质有较强吸收，就可方便地 检出该化合物中痕量杂质。例如乙醇中有无杂质苯，只要观察在 256 nm 处有无苯的吸收即 可，因为苯在此有吸收而乙醇无吸收。 若主成分有吸收，而杂质无吸收，则可在主成分的λmax处测量吸收系数，并与理论值比 较来检查纯度。 收或透射．如图 9 一 1 所示。若被照射物系均匀溶液，则光的散射可以忽略。 人眼能感觉到的光称为可见光。在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜 色。当一束白光（由各种波长的光按一定比例组成）如 日光或白炽灯光等通过某一有色溶液时，一些波长的光 被溶液吸收，另一些波长的光则透过。透射光（或反射 光）刺激人眼而使人感觉到颜色的存在。因此溶液的颜
色由透射光的波长所决定。能够组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。如硫酸 铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈现蓝色，黄色与蓝色即为补色。表 一1列出了物质颜色 与吸收光颜色的互补关系。 表9-1物质颜色与吸收光颜色的互补关系 吸收光 物质颜色 额色 波长/nm 黄绿 400-450 黄 450-480 绿蓝 480-490 490-500 500一56 黄 560-58 580-60 当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞” 光子的能量被分子、原子所吸收，使这些特子由最低能本（基态）跃千到较高能态（激发态） M+hw一M (基态) (藏发态) 被激发的粒子约在10s后又回到基态，并以热或荧光等形式释放能量。 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，如图9一2.仅当照射光的光子能量(v) 与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构 不同而具有不同的最子化能级，其能量差也不相同， 所以物质对光的吸收具有选择性。 0 TB 0.40 。 1 0.100 纯装动 0 -0 图9-2 双原子分子能级跃进 图9-31,10-邻二氮杂菲亚 A,B为电子能级， =0,1,1 为A 铁溶液的吸收曲线 各动能级，=0,1,2， ”为=0 动能级中各转动能级
色由透射光的波长所决定。能够组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。如硫酸 铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈现蓝色，黄色与蓝色即为补色。表 9一 1列出了物质颜色 与吸收光颜色的互补关系。 当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”， 光子的能量被分子、原子所吸收，使这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能态（激发态）： 被激发的粒子约在 10 －8 s 后又回到基态，并以热或荧光等形式释放能量。 分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，如图 9—2。仅当照射光的光子能量（hv） 与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时才能发生吸收。不同的物质微粒由于结构 不同而具有不同的量子化能级，其能量差也不相同。 所以物质对光的吸收具有选择性
将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的 吸收程度（即吸光度A),然后以波长为横坐标，以吸光度A为纵坐标作图，即可得吸收曲 线（吸收光谱，absorption spectrum)。它描述了物质对不同波长光的吸收能力。如图9 所示，图中I、Ⅱ、Π分别为0.0002mg·mL、0.0004mg·mL和0.0006mg·mL的 1,10一邻二氨杂菲亚铁的吸收曲线。可见，对不同波长的光吸收情况不同。对510m的绿 色光吸收最多，有一吸收高峰，相应的波长称最大吸收波长，用)m表示。对波长600m 以卜的橙红色光，则几乎不吸收，完全透过，所以溶液呈现橙红色。这说明了物质呈色的原 因及对光的选择性吸收。不同物质其吸收曲线的形状和最大吸收波长各不相同。根据这个特 性可用作物质的初步定性分析。不同浓度的同一物质，最大吸收波长不变，在吸收蜂及附 处的吸光度随浓度增加而增大。根据这个特性可对物质定量分析。若在)x处测定吸光度， 则灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度法定量分析时选择测定波长的重要依据。 光的吸收基本定律—朗伯一比尔定律 当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶质吸收了光能，光的 强度就要减弱。溶液的浓度C愈大，液层厚度b愈厚，人射光愈强，则光被吸收得愈多， 光强度的减弱也愈显著。它是由实验观察得到的。 A=-lg T=lg=alx (9-1) 式中：A为吸光度(absorbance)：片T为透光度(transmltance),T曰/I0,l0为人射光强度：I 为透射光强度。比例常数a称为吸收系数，A为量纲为一的量，通常b以cm为单位，如 果c以g·L-1为单位，则a的单位为L·g-1·am一1。如c以molL-1为单位，则 此时的吸收系数称为摩尔吸收系数(molar absorPivity),用符号k表示，单位为L·mol ·c一1。于是(9-1)式可表示为 A=kbc (9-2) 式(9一1)和式(9-2)是朗伯一比尔(Lambert-一Bcer)定律的数学表达式。此定律不仅 适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质（气体或固体），是各类吸光光度法定量 分析的依据。这种关系也常用回归方程式表示 剂的情况下的 处我整光程中的吸光，是物质吸光能力的最度。它可作为定性整定的 特征常数，数 上等于浓度 为m0 也可用以估量定量方法的灵敏度：k值念大，方法的灵敏度愈高。由实验结果计算k时，常 以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，这样计算的k值实际上是表观摩尔吸收系数。 k与a的关系为 k=Md (9-3) 式中M为物质的摩尔质量。 在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等于各组 分吸光度之和，即吸光度具有加和性。由此可得 Ae=A1+A2+.+A=11+2bce2+.+,c (9-4) 式中下角标指吸收组分1,2，n
将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的 吸收程度（即吸光度 A），然后以波长为横坐标，以吸光度 A 为纵坐标作图，即可得吸收曲 线（吸收光谱，absorption spectrum）。它描述了物质对不同波长光的吸收能力。如图 9—3 所示，图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为 0.000 2mg·mL－l、0.000 4 mg·mL－l 和 0.000 6 mg·mL－l的 1，10－邻二氮杂菲亚铁的吸收曲线。可见，对不同波长的光吸收情况不同。对 510 nm 的绿 色光吸收最多，有一吸收高峰，相应的波长称最大吸收波长，用 λmax 表示。对波长 600 nm 以卜的橙红色光，则几乎不吸收，完全透过，所以溶液呈现橙红色。这说明了物质呈色的原 因及对光的选择性吸收。不同物质其吸收曲线的形状和最大吸收波长各不相同。根据这个特 性可用作物质的初步定性分析。不同浓度的同一物质，最大吸收波长不变，在吸收峰及附近 处的吸光度随浓度增加而增大。根据这个特性可对物质定量分析。若在 λmax 处测定吸光度， 则灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度法定量分析时选择测定波长的重要依据。 光的吸收基本定律——朗伯一比尔定律 当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶质吸收了光能，光的 强度就要减弱。溶液的浓度 C 愈大，液层厚度 b 愈厚，人射光愈强，则光被吸收得愈多， 光强度的减弱也愈显著。它是由实验观察得到的。 式中：A 为吸光度（absorbance）；T 为透光度（transmlttance），T=I／I0,I0 为人射光强度；I 为透射光强度。比例常数 a 称为吸收系数，A 为量纲为一的量，通常 b 以 cm 为单位，如 果 c 以 g·L－l 为单位，则 a 的单位为 L·g–1·cm—1。如 c 以 mol·L－1 为单位，则 此时的吸收系数称为摩尔吸收系数（molar absorPtivity），用符号 k 表示，单位为 L·mol— l·cm—1。于是（9—1）式可表示为 A=kbc （9－2） 式（9 一 1）和式（9－2）是朗伯一比尔（Lambert—Beer）定律的数学表达式。此定律不仅 适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质（气体或固体〕，是各类吸光光度法定量 分析的依据。这种关系也常用回归方程式表示。 K 是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为 lmol·L －1 吸光物质在 1cm 光程中的吸光度，是物质吸光能力的量度。它可作为定性鉴定的参数， 也可用以估量定量方法的灵敏度：k 值愈大，方法的灵敏度愈高。由实验结果计算 k 时，常 以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，这样计算的 k 值实际上是表观摩尔吸收系数。 k与 a 的关系为 k＝Md （9—3） 式中 M 为物质的摩尔质量。 在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，这时体系的总吸光度等于各组 分吸光度之和，即吸光度具有加和性。由此可得 式中下角标指吸收组分 1，2，.，n
偏离比尔定律的原因 通常在分光光度定量分析中，需要绘制标准曲线，即在固定液层厚度及人射光的波长和 强度的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓 度为横坐标作图。根据朗伯一比尔定律，这时应得到一条通过原点的直线。该直线称为标准 曲线或工作曲线。在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上就可查得试液的浓度，这 就是工作曲线法。但在实际工作中，特别是在溶液浓度较高时，常会出现标准曲线不成直线 (如图、 示)的现象 这种现象称为偏离比尔 律 待测试 液浓 在标 弯曲部分，则根据吸光度计算试样浓度时将引人较大的误差。因此，了解偏离比尔定律的原 因，以便对测定条件作适当的选择和控制。 引起偏离比尔定律的主要原因是目前仪器不能提供 真正的单色光（由同 长的光子组成的光)，以及吸光 物质性质的改变，并不是由定律本身不严格所引起的。因 一偏离 此，这种偏离只能称为表观偏离，现就引起偏离的主要原 因讨论如下。 非单色光引起的偏离朗伯一比尔定律的基本假 设条件是人射光为单色光。但目前仪器所提供的人射光实 际上是由波长范围较窄的光带组成的复合光。由于物质为 图9一4光度分析工作白线 不同波长光的吸收程度不同，因而引起了对比尔定律的偏离。为讨论方便起见，假设人射光 仅由两种波长入1和2的光组成，两波长下比尔定律是适用的。 对于，吸光度为A',则 A=g,l=6×10 对于2，吸光度为A”,则 A=g4=×10 复合光时，人射光强度为(。'+H。”),透视光强度为（'+山，”），因此，所的吸光度为 A=+ (9-5) (I) A=g×10*+i6×104 (9-6) 当kk?时，A=kbc成直线关系。如果k≠k,A与c则不成直线关系。k与k差别愈 大人与℃间线性关系的偏离也愈大。其他条件一定时，k随人射光波长而变化，但)处附近k 变化不大。当选用入：。x波长处的光作人射光，所引起的偏离就小，标准曲线基本上成直线。 一5中左图 音a的复合光进行测 得到 右图的工作曲： 线日 ,A与c基本呈直线 用谱带b的复合光进行测量，k的变化较大，则A随波长的布 工作曲线b'A与c的关系明显偏离线性
偏离比尔定律的原因 通常在分光光度定量分析中，需要绘制标准曲线，即在固定液层厚度及人射光的波长和 强度的情况下，测定一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓 度为横坐标作图。根据朗伯一比尔定律，这时应得到一条通过原点的直线。该直线称为标准 曲线或工作曲线。在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上就可查得试液的浓度，这 就是工作曲线法。但在实际工作中，特别是在溶液浓度较高时，常会出现标准曲线不成直线 （如图 9—4 虚线所示）的现象，这种现象称为偏离比尔定律。若待测试液浓度在标准曲线 弯曲部分，则根据吸光度计算试样浓度时将引人较大的误差。因此，了解偏离比尔定律的原 因，以便对测定条件作适当的选择和控制。 引起偏离比尔定律的主要原因是目前仪器不能提供 真正的单色光（由同一波长的光子组成的光〕，以及吸光 物质性质的改变，并不是由定律本身不严格所引起的。因 此，这种偏离只能称为表观偏离，现就引起偏离的主要原 因讨论如下。 非单色光引起的偏离 朗伯一比尔定律的基本假 设条件是人射光为单色光。但目前仪器所提供的人射光实 际上是由波长范围较窄的光带组成的复合光。由于物质对 不同波长光的吸收程度不同，因而引起了对比尔定律的偏离。为讨论方便起见，假设人射光 仅由两种波长 λ1和 λ2的光组成，两波长下比尔定律是适用的。 对于 λ1，吸光度为 A′，则 对于 λ2，吸光度为 A〞，则 复合光时，人射光强度为 (I0′+I0〞),透视光强度为（I1′+I2〞），因此，所的吸光度为 或 当 k1=k2时，A=kbc 成直线关系。如果 k ≠ k2，A 与 c 则不成直线关系。k1 与 k2差别愈 大人与 c 间线性关系的偏离也愈大。其他条件一定时，k随人射光波长而变化。但 λmax 处附近 k 变化不大。当选用入；。x 波长处的光作人射光，所引起的偏离就小，标准曲线基本上成直线。 如用图 9 一 5 中左图的谱带 a 的复合光进行测量，得到右图的工作曲线 a′,A 与 c 基本呈直线 关系。反之选用谱带 b 的复合光进行测量，k 的变化较大，则 A 随波长的变化较明显，得到的 工作曲线 b′,A 与 c 的关系明显偏离线性
一工作曲线a' 之工作曲线 图9-5复合光对比尔定徘的影响 化学因素引起的偏离朗伯一比尔定律除要求人射光是单色光外，还假设吸光粒子是独立 的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。在高浓度时（通常>0.01m©·L) 由于吸光粒子间的平均距离成小，以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布.这种相互作 用可使它们的吸光能力发生改变。由于相互作用的程度与浓度有关，随浓度增大，吸光度与浓 度间的关系就偏离线性关系。所以 般认为比尔定律仅适用于稀溶液 此外，由吸光物质等构成的溶液化学体系，常因条件的变化而发生吸光组分的缔合、离解、 互变异构。配合物的逐级形成以及与溶剂的相互作用等，从而形成新的化合物或改变吸光物质 的浓度，都将导致偏离比尔定律。因此须根据吸光物质的性质，溶液中化学平衡的知识，严格 控制显色反应条件，对偏离加以预测和防止，以获得较好的测定效果。 例如，重铬酸钾在水溶液中存在如下平衡，如果稀释溶液或增大溶液pH,Cr,0,就转变 成CO:“，吸光质点发生变化，从而引起偏离比尔定律。如果控制溶液均在高酸度时测定，由 于六价铬均以重铬酸根形式存在，就不会引起偏离。 C,0+H,02H*+2Cr0 (橙色) (黄色) §8一2光度计及其基本部件 吸光度的测定使用分光光度计(spectfophotornete)进行。有紫外一可见分光光度计， 可见分光光度计之分，种类和型号也繁多，按结构来说，可分为单波长单光束分光光度计 单波长双光束分光光度计、双波长分光光度计。单波长单光束分光光度计最常见，其结构 下所示：特点是结构简单，参考池与样品吸收池先后被置于光路，时间间隔较长，若此时间 内光源强度有波动，易带来测量误差，因此要求稳定的光源电源。 单波长单光束分光光度计 单被长单光束分光光度计 单色器 施☐ 最常见的国产721型可见分光光度计的光路结构如图9一6，这是一种单光束单波长 分光光度计，采用光电管检测器，工作波长范围为360一800m
化学因素引起的偏离 朗伯一比尔定律除要求人射光是单色光外，还假设吸光粒子是独立 的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。在高浓度时（通常＞0.01mol·L －l） 由于吸光粒子间的平均距离减小，以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布，这种相互作 用可使它们的吸光能力发生改变。由于相互作用的程度与浓度有关，随浓度增大，吸光度与浓 度间的关系就偏离线性关系。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。 此外，由吸光物质等构成的溶液化学体系，常因条件的变化而发生吸光组分的缔合、离解、 互变异构。配合物的逐级形成以及与溶剂的相互作用等，从而形成新的化合物或改变吸光物质 的浓度，都将导致偏离比尔定律。因此须根据吸光物质的性质，溶液中化学平衡的知识，严格 控制显色反应条件，对偏离加以预测和防止，以获得较好的测定效果。 例如，重铬酸钾在水溶液中存在如下平衡，如果稀释溶液或增大溶液 pH，Cr2O7 2－就转变 成 CrO4 2–，吸光质点发生变化，从而引起偏离比尔定律。如果控制溶液均在高酸度时测定，由 于六价铬均以重铬酸根形式存在，就不会引起偏离。 §8 一 2 光度计及其基本部件 吸光度的测定使用分光光度计（spectfophotornete）进行。有紫外一可见分光光度计， 可见分光光度计之分，种类和型号也繁多，按结构来说，可分为单波长单光束分光光度计、 单波长双光束分光光度计、双波长分光光度计。单波长单光束分光光度计最常见，其结构如 下所示；特点是结构简单，参考池与样品吸收池先后被置于光路，时间间隔较长，若此时间 内 光 源 强 度 有 波 动 ， 易 带 来 测 量 误 差 ， 因 此 要 求 稳 定 的 光 源 电 源 。 单波长单光束分光光度计 最常见的国产 721 型可见分光光度计的光路结构如图 9－6，这是一种单光束单波长 分光光度计，采用光电管检测器，工作波长范围为 360～800 nm