DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50-100 mM pH 7.5 Mgcl 10 mM ATP 0.5-1mM DTT 5 mM Volume 0-=20山 4-15C4-16hr 1UDNA连接酶的酶活性:在最佳反应条件下15℃反应1小时, 完全连接1gλ-DNA(HindⅢ片段)所需的酶量
DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 连接酶的反应条件 Tris-HCl Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5 50 - 100 mM pH 7.5 MgCl MgCl22 10 mM 10 mM ATP ATP 0.5 - 1 mM 0.5 - 1 mM DTT DTT 5 mM 5 mM Volume Volume 10 - 20 10 - 20 µµll T T T T 4 - 15 4 - 15 ℃℃ 4 - 16 hr 4 - 16 hr 1 U DNA 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下 连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 ℃℃反应反应 1 1 小时， 小时， 完全连接 完全连接 1 1 µµg g λλ-DNA -DNA（（Hind III Hind III片段）所需的酶量 片段）所需的酶量
DNA连接酶 平头双链DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲,由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接,而平头末端的连接则属于分子间的连 接,因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括: ●加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接) 加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞机会 ●加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用 ●加入单价阳离子(NaC|),最终浓度150-200mM
DNA连接酶 平头双链DNA片段的连接操作 片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的 连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连 接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（ 加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接） 倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入加入10% PEG8000 10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 ，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（ 加入单价阳离子（NaCl NaCl），最终浓度 ），最终浓度150-200 mM 150-200 mM
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶丨( DNA po||) 大肠杆菌DNA聚合酶的基本性质:5→3的DNA聚合酶活性 5“→3“的核酸外切酶活性 3“→5的核酸外切酶活性 3∴ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A5 5∴ C-GA-G-T0H DNA pol I 5 ppp dN Mg 3G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A. 5 5C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I DNA pol I ） 55‘‘→3 →3‘‘的的DNA DNA聚合酶活性 聚合酶活性 55‘‘→3 →3‘‘的核酸外切酶活性 的核酸外切酶活性 33‘‘→5 →5‘‘的核酸外切酶活性 的核酸外切酶活性 大肠杆菌 大肠杆菌DNA DNA聚合酶 聚合酶 II的基本性质： 的基本性质： 3‘ … G 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C 5‘ … C-G-A-G-T- -G-A-G-T-OHOH 5‘ ppp dN Mg 5‘ ppp dN Mg2+2+ 3‘ … G 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’ 5‘ … C 5‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C- -G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHOH DNA pol I DNA pol I
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|( DNA pol I) 大肠杆菌DNA聚合酶的基本用途: 5∴ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3 缺口前移标记法 3∴ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A.5 Nick translation DNase I 制备32P标记的探针 5°∴ G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T..3 3∴ C-G-A-G-T-C-G-AC-C-T-C-A..5 DNA pol I Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA (a-32P-dATP 5°∴ G-C-T-C-A-G-C-T-G-G A-G-T33 3∴ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A.5°
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I DNA pol I ） 缺口前移标记法 缺口前移标记法 大肠杆菌 大肠杆菌DNA DNA聚合酶 聚合酶 I I 的基本用途： 的基本用途： 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ -G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（α- Mg2+ 5‘ dNTP 5‘ ppp dA（α-3232P-dATP P-dATP）） 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ -C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ -G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ -G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5‘ Nick translation Nick translation 制备制备3232PP标记的探针 标记的探针 DNase I DNase I DNA pol I DNA pol I
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|大片段( Klenow) Klenow酶的基本性质: 大肠杄菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理,获得N端 分之二的大肽段,即为 Klenow酶 Klenow酶仍拥有5→3的DNA聚合酶活性和3“→5的核 核酸外切酶活性,但失去了5→3的核酸外切酶活性
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow Klenow酶的基本性质： 酶的基本性质： 大肠杆菌 大肠杆菌DNA DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得 聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得NN端端 三分之二的大肽段，即为 三分之二的大肽段，即为Klenow Klenow酶酶 Klenow Klenow酶仍拥有 酶仍拥有55‘‘→3 →3‘‘的的DNA DNA聚合酶活性 聚合酶活性和和33‘‘→5 →5‘‘的核的核 核酸外切酶活性 核酸外切酶活性，但失去了 ，但失去了55‘‘→3 →3‘‘的核酸外切酶活性 的核酸外切酶活性