限制性核酸內切酶 影响限制性核酸內切酶活性的因素 DNA样品的甲基化程度 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N位 引入甲基,受其影响的酶有BcI、Mbol等,但BamH| Bgl、sau3A|不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5 CCAGG3或5 CCTGG3序列 中的胞嘧啶C5位上引入甲基,受其影响的酶有EcoR‖等 哺乳动物中的甲基化酶在5℃G3序列中的C5位上引入甲基
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA DNA样品的甲基化程度： 样品的甲基化程度： 大肠杆菌中的 大肠杆菌中的dam dam甲基化酶在 甲基化酶在5‘GATC3’ 5‘GATC3’序列中的腺嘌呤 序列中的腺嘌呤NN66位位 引入甲基，受其影响的酶有 引入甲基，受其影响的酶有Bcl I Bcl I、、MboI MboI等，但 等，但BamH I BamH I、、 Bgl II Bgl II、、Sau3A I Sau3A I不受影响 不受影响 大肠杆菌中的 大肠杆菌中的dcm dcm甲基化酶在 甲基化酶在5‘CCAGG3’ 5‘CCAGG3’或或5‘CCTGG3’ 5‘CCTGG3’序列序列 中的胞嘧啶 中的胞嘧啶CC55位上引入甲基，受其影响的酶有 位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II EcoR II等等 哺乳动物中的甲基化酶在 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’ 5‘CG3’序列中的 序列中的CC55位上引入甲基 位上引入甲基
限制性核酸內切酶 影响限制性核酸內切酶活性的因素 核酸内切酶的缓冲液性质 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等, 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性,即 所谓的 Star activity现象 EcoR|在正常条件下识别并切割5 GAATTO3序列,但在甘 油浓度超过5%(W)时,也可切割5 PuPUATPyPy3或者 5AATT3
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 影响限制性核酸内切酶活性的因素 核酸内切酶的缓冲液性质： 核酸内切酶的缓冲液性质： 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pHpH值值等，等， 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即 会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即 所谓的 所谓的Star activity Star activity现象现象 EcoR I EcoR I在正常条件下识别并切割 在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’ 5‘GAATTC3’序列，但在甘 序列，但在甘 油浓度超过 油浓度超过5%5%（（v/v v/v）时，也可切割 ）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’ 5‘PuPuATPyPy3’或者或者 5‘AATT3’ 5‘AATT3’
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 nick 5G-C-T-C--G-C-A G-G-A-G. 3 36∴cGA-GA-C-G-CTC∴.53 P OH nick DNA连接酶 5∴ G-C-T-C-T-C-C-A-GGAG∴.33 3∴cGA-G-A-C-G-CCTC∴5
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接酶的基本性质 修复双链 修复双链DNA DNA上缺口处的磷酸二酯键 上缺口处的磷酸二酯键 DNA DNA连接酶 连接酶 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OHOH PP PP OHOH 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ -C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ nick nick nick nick
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5∴ G-C-U-C-U-G- C-C-G-G-A-G..3 36… C-G-A-GA-C-G-G-C-C-T-O..5 P oH nick T4-DNA连接酶 5∴GCU- C-U-G-C-C-G-G-A-G∴3 3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-0∴5
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接酶的基本性质 修复与 修复与RNA RNA链结合的 链结合的DNA DNA链上缺口处的磷酸二酯键 链上缺口处的磷酸二酯键 T4-DNA T4-DNA连接酶 连接酶 5‘ …5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ -G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ PP OHOH nick nick 5‘ …5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C … 5’
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接多个平头双链DNA分子: 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G∴3 3∴ C-G-A-G-T-C-P OHGA-c-CTC∴.5 T4-DNA连接酶 5∴. G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G∴33 3. C-G-A-G-T-C-G-A-CCTC∴5
DNA连接酶 DNA连接酶的基本性质 连接酶的基本性质 连接多个平头双链 连接多个平头双链DNA DNA分子： 分子： 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G- -C-T-C-A-G-OH P OH P--C-T-G-G-A-G … 3’ C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C- -G-A-G-T-C-P OH P OH--G-A-C-C-T-C … 5’ G-A-C-C-T-C … 5’ T4-DNA T4-DNA连接酶 连接酶