DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|大片段( Klenow) K|enoW酶的基本用途 补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 ●cDNA第二链的合成 ●双脱氧未端终止法测定DNA序列
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow Klenow酶的基本用途： 酶的基本用途： 补平由核酸内切酶产生的5 补平由核酸内切酶产生的5‘‘粘性末端 粘性末端 DNA DNA片段的同位素末端标记 片段的同位素末端标记 cDNA cDNA第二链的合成 第二链的合成 双脱氧末端终止法测定 双脱氧末端终止法测定DNA DNA序列序列
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|大片段( Klenow) enow酶的基本用途:补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 5.G-C-T-G-OH PA-A- T-T-C-G-A-c∴3 3C-G-A-C-T-A-A-P OH-GCTC∴.53 Klenow datP dTP 5°∴ G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A- T-T-C-G-A-G.3 3∴cGA-C-TA-A- TTAA-GCTC∴.5
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow Klenow酶的基本用途： 酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5 补平由核酸内切酶产生的5‘‘粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G- -C-T-G-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH P OH--G-C-T-C … 5’ G-C-T-C … 5’ Klenow Klenow dATP dTTP dATP dTTP 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T- -C-T-G-A-A-T-T-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH- P OH-TT-T-A-A-G-C-T-C … 5’ -T-A-A-G-C-T-C … 5’
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶|大片段( Klenow) 〈enoW酶的基本用途:DNA片段的同位素末端标记 5°∴GCTG-0H P-A-A-T-T-C-G-A-G.3 3∴ C-G-A-C-T-T-AA-P OH-G-C-T-C∴.53 Klenow a-32P-pppda dTTP 5G-C-T-GAAT-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G3 3∴ C-G-A-C-T-T-A-A- P OHT-TAA-G-C-T-C∴.53
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） Klenow Klenow酶的基本用途： 酶的基本用途： DNA DNA片段的同位素末端标记 片段的同位素末端标记 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G- -C-T-G-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH P OH--G-C-T-C … 5’ G-C-T-C … 5’ Klenow Klenow α- α- 32P-pppdA dTTP 32P-pppdA dTTP 5‘ … G 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T- -C-T-G-A-A-T-T-OH P OH P--A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A- -G-A-C-T-T-A-A-P OH- P OH-TT-T-A-A-G-C-T-C … 5’ -T-A-A-G-C-T-C … 5’
DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA酶的基本特性 ●5→3的DNA聚合酶活性和3→5的核酸外切酶活性 ●在无dNTP时,可以从任何3-OH端外切 在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种GNTP均存在时,聚合活性占主导地位
DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA T4-DNA酶的基本特性： 酶的基本特性： 在无在无dNTP dNTP时，可以从任何 时，可以从任何3‘-OH 3‘-OH端外切 端外切 在只有一种 在只有一种dNTP dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种 在四种dNTP dNTP均存在时，聚合活性占主导地位 均存在时，聚合活性占主导地位 55‘‘→3 →3‘‘的的DNA DNA聚合酶活性和 聚合酶活性和33‘‘→5 →5‘‘的核酸外切酶活性 的核酸外切酶活性
DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶的基本用途:切平由核酸内切酶产生的3.性末端 5∴. G-C-T-C-T-G-C-A=0H P-G-G-A-G.3 3C-G-A-G-P HO-A-C-G--C-C-T-C 5 T4DNA聚合酶 5G-C-T-C- OH GGAG∴3 36∴cGA-G-PHo-CCTC∴5 注意:该酶也能降解双链DNA,只是其活性比单链降解活性低很多
DNA聚合酶 T4-DNA聚合酶 T4-DNA T4-DNA聚合酶的基本用途： 聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3 切平由核酸内切酶产生的3’’粘性末端 粘性末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A- -C-T-C-T-G-C-A-OH P OH P--G-G-A-G … 3’ G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G- -G-A-G-P HO P HO--A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ T4-DNA T4-DNA聚合酶 聚合酶 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C- -C-T-C- OH P OH P--G-G-A-G … 3’ G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G- -G-A-G-P HO P HO --C-C-T-C … 5’ C-C-T-C … 5’ 注意：该酶也能降解双链 注意：该酶也能降解双链DNA DNA，只是其活性比单链降解活性低很多 ，只是其活性比单链降解活性低很多