Pv山等产生的平头末端 5∴GcTC-A-G-C-GGAG∴3 3∴cGA-GTCG-A-CCTC∴.53 Pvu37℃ 5°∴GCTC-A-G-0H PC-T-GGAG∴3 3∴cGA-G-C-P OH-G-A-C-C-T-C. 5
PvuII PvuII等产生的平头末端 等产生的平头末端 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ -C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ -G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuII 37 PvuII 37 ℃℃ 5‘ … G 5‘ … G-C-T-C-A-G- -C-T-C-A-G-OH P OH P--C-T-G-G-A-G … 3’ C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C 3‘ … C-G-A-G-T-C- -G-A-G-T-C-P OH P OH--G-A-C-C-T-C … 5’ G-A-C-C-T-C … 5’
限制性核酸內切酶 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分l型核酸内切酶需要相似的反应条件: Tris-HCl 50 mM pH 7.5 Mgcl2 10 mM 0-50mM低盐酶 Nacl 0-150mM 100mM中盐酶 DTT 1 mM 150mM高盐酶 oume20-100 TT 37C1-1.5hr 1U核酸内切酶的酶活性:在最佳反应条件下反应1小时,完全 水解1μg标准DNA所需的酶量
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 大部分 大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件： 型核酸内切酶需要相似的反应条件： Tris-HCl Tris-HCl 50 mM pH 7.5 50 mM pH 7.5 MgCl MgCl22 10 mM 10 mM NaCl NaCl 0 - 150 mM 0 - 150 mM DTT DTT 1 mM 1 mM 0 - 50 mM 0 - 50 mM 低盐酶 低盐酶 100 mM 100 mM 中盐酶 中盐酶 150 mM 150 mM 高盐酶 高盐酶 Volume Volume 20 - 100 20 - 100 µµll T T T T 37 37 ℃℃ 1 - 1.5 hr 1 - 1.5 hr 1 U 1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 1 小时，完全 小时，完全 水解水解 1 1 µµg g 标准标准DNA DNA所需的酶量 所需的酶量
限制性核酸內切酶 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 H型核酸内切酶的多酶联合酶解: 对盐浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶切,但应注意: BamhI smal 5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT 3 3. CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA.5 5°. GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT.3 3 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA. 5 5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT.3 3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA. 5
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意： 5‘ …GCTACAT 5‘ …GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’ GGATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTA 3‘ …CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ CCTAGGGCCCAAGCGTA…5’ BamHI SmaI BamHI SmaI 5‘ …GCTACAT 5‘ …GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT…3’ G GATCCCGGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTA 3‘ …CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ CCTAG GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACAT 5‘ …GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT…3’ GGATCCC GGGTTCGCAT…3’ 3‘ …CGATGTA 3‘ …CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA…5’ CCTAGGG CCCAAGCGTA…5’
限制性核酸內切酶 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 H型核酸内切酶的多酶联合酶解: 对盐浓度要求不同的酶,可采取下列方法: ●使用较贵的酶的盐浓度,加大便宜酶的用量,同时酶解 低盐酶先切,然后补加盐,高盐酶再切 种酶先切,然后更换缓冲液,另一种酶再切 0倍体积的5 M NaAc ph5.4 2.5倍体积的冰冷乙醇 冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 II II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切 0.1 0.1倍体积的 倍体积的 5 M NaAc pH 5.4 5 M NaAc pH 5.4 2.5 2.5倍体积的冰冷乙醇 倍体积的冰冷乙醇 冰浴冰浴 5 5 分钟、高速冷冻离心 分钟、高速冷冻离心1010分钟、干燥 分钟、干燥
限制性核酸內切酶 影响限制性核酸內切酶活性的因素 DNA样品的纯度 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaC等 加大酶的用量,1DNA用10U酶 加大反应总体积 ●延长反应时间
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 影响限制性核酸内切酶活性的因素 影响限制性核酸内切酶活性的因素 DNA DNA样品的纯度： 样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA EDTA、、SDS SDS、、NaCl NaCl等等 加大酶的用量， 加大酶的用量，1 1 µµg DNA g DNA 用用 10U 10U 酶酶 加大反应总体积 加大反应总体积 延长反应时间 延长反应时间