位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于DA双链的合成延伸均为 5'一3'的方向，因此复制是以半不连续(semidiscontinuous)的方式进行，即其中一条链 相对地连续合成，称之为领头链(leading strand),另一条链的合成是不连续的，称为随 后链(lagging strand)。在DNA复制叉上进行的基本活动包括双链的解开：RNA引物的 合成：DNA链的延长：切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段。 双链的解开 很多实验都证明了复制是从DNA分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常 用o表示。许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。这一区段产生的瞬时单链与单 链结合蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所 有DNA的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状DNA也不是从末端开始复制的 DNA复制速率的调节主要在于起始频率，而DNA延长的速度则大体上是恒定的。在迅 速生长的细菌中， 当第一次复制起始后，在复制未完成之前，复制原点可以起始第二之 复制，这可加快复制的速度。真核细胞可以在DA链上的多个不同位点同时起始进行复 制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于真核细胞可以在多个位点同时 进行，其总速度反而比原核细胞快。 在D八A的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补 链。在起点处形成 个“眼 状结构 在“眼”的 端 则出现两个叉子状的生长点 称为复制义(replication fork).在有韦 结合久种久样制右的酶和辅助因子 如DNA解旋酶， 合体称为复制体 拓扑异构 体相似大小的复 -10)。 ep蛋白 解螺旋酶 单链结合蛋白、 一引发体 DNA 厂引物RNA DNA聚合酶 DNA聚合I “网鳞片段 DNA连接酬 领头链 随后链 图10-10大肠杆菌的复制叉结构示意图 2.RNA引物的合成 在DNA复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构 303
303 位点开始，可以单向或双向进行，但是以双向复制为主。由于 DNA 双链的合成延伸均为 5′→3′的方向，因此复制是以半不连续（semidiscontinuous）的方式进行，即其中一条链 相对地连续合成，称之为领头链（leading strand），另一条链的合成是不连续的，称为随 后链（lagging strand）。在 DNA 复制叉上进行的基本活动包括双链的解开；RNA 引物的 合成；DNA 链的延长；切除 RNA 引物，填补缺口，连接相邻的 DNA 片段。 1． 双链的解开 很多实验都证明了复制是从 DNA 分子的特定位置开始的，这一位置叫复制原点，常 用 ori 表示。许多生物的复制原点都是富含 A、T 的区段。这一区段产生的瞬时单链与单 链结合蛋白结合，对复制的起始十分重要。原核生物基因组一般只有一个复制原点。所 有 DNA 的复制原点都处于双螺旋结构内部，就是线状 DNA 也不是从末端开始复制的。 DNA 复制速率的调节主要在于起始频率，而 DNA 延长的速度则大体上是恒定的。在迅 速生长的细菌中，当第一次复制起始后，在复制未完成之前，复制原点可以起始第二次 复制，这可加快复制的速度。真核细胞可以在 DNA 链上的多个不同位点同时起始进行复 制，所以原核细胞的复制速度尽管比真核细胞快，但由于真核细胞可以在多个位点同时 进行，其总速度反而比原核细胞快。 在 DNA 的复制原点，双股螺旋解开，成单链状态，分别作为模板，各自合成其互补 链。在起点处形成一个“眼”状结构。在“眼”的两端，则出现两个叉子状的生长点， 称为复制叉（replication fork）。在复制叉上结合着各种各样与复制有关的酶和辅助因子， 如 DNA 解旋酶，引发体和 DNA 聚合酶，它们在 DNA 链上构成与核糖体相似大小的复 合体称为复制体（replisome）。彼此配合，进行高度精确的复制（图 10-10）。 图 10-10 大肠杆菌的复制叉结构示意图 2． RNA 引物的合成 在 DNA 复制的起始处双链解开，领头链先引发开始合成，与其模板形成双链结构
而另一条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来， 能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发 体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发RNA引物的合成。移动和引发均需要由 ATP提供能量。以DNA为模板按5'→3'的方向，合成一段引物RNA链。引物长度约为 几个至10个核苷酸。在引物的5'端含3个磷酸残基，3'端为游离的羟基。 3.DNA链的延长 当RNA引物合成之后，在DNA聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷5'三磷 酸为底物，在RNA引物的3'端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出PPi。DNA 链的合成是以两条亲代DNA链为模板，按碱基配对原则进行复制的。亲代DNA的双股 链呈反向平行，一条链是5'一3'方向，另一条链是3'一5'方向。在一个复制又内两条 链的复制方向不同（图1011），所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为山 还没有发现 DNA聚合酶能按3 5'方向延伸，因此子链中有 条链沿着亲代DN 单链的3'一5'方向（亦即新合成的DNA沿5'一3'方向）不断延长。这条新链称为领 链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成5’一3'的多个短 片段。1968年冈崎发现了这些片段故又称冈崎片段(Okazaki fragment)。它们随后连接 成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成，随后链是断续合成的方式称 为半不连续复制( iscontinuo 。)原核细胞冈岭片段长度约为 000-2000 个核苷酸。真核细胞的较短，长度约100~200个核苷酸。 起点 复制叉 ,复制灵 3 。5 倾头通 3领头链 3后 、3 延伸 延伸 图I0-1DNA的双向复制 尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随 后链保持相对稳定的一段距离.1988年Kornberg等人从大肠杆菌中分离出8 00kDa的pol Ⅲ*和90OkDa的olⅢ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对 称结构，这表明同 个pⅢ全酶可能同时负贵领头链和随后链的复 根据实验资料 提出如下复制模型（图10-12），随后链的模板在DNA聚合酶全酶上绕转180度形成 个小环，使冈崎片断的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持 致。随若冈崎片断的延长，这个大环从DNA聚合酶Ⅲ上释放。在此之前，领头链的合成 己将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物， 304
304 而另一条亲代链则被置换出来。只有在领头链将另一条亲本链的特别序列置换出来，才 能产生随后链的前体片段的前引发作用。需要引发酶与引发前体结合形成引发体。引发 体在复制叉上移动，识别合成的起始点，引发 RNA 引物的合成。移动和引发均需要由 ATP 提供能量。以 DNA 为模板按 5′→3′的方向，合成一段引物 RNA 链。引物长度约为 几个至 10 个核苷酸。在引物的 5′端含 3 个磷酸残基，3′端为游离的羟基。 3． DNA 链的延长 当 RNA 引物合成之后，在 DNA 聚合酶Ⅲ的催化下，以四种脱氧核糖核苷 5′-三磷 酸为底物，在 RNA 引物的 3′端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出 PPi。DNA 链的合成是以两条亲代 DNA 链为模板，按碱基配对原则进行复制的。亲代 DNA 的双股 链呈反向平行，一条链是 5′→3′方向，另一条链是 3′→5′方向。在一个复制叉内两条 链的复制方向不同（图 10-11），所以新合成的二条子链极性也正好相反。由于迄今为止 还没有发现一种 DNA 聚合酶能按 3′→5′方向延伸，因此子链中有一条链沿着亲代 DNA 单链的 3′→5′方向（亦即新合成的 DNA 沿 5′→3′方向）不断延长。这条新链称为领头 链。而另一条链的合成方向与复制叉的前进方向相反，只能断续地合成 5′→3′的多个短 片段。1968 年冈崎发现了这些片段故又称冈崎片段（Okazaki fragment）。它们随后连接 成大片段，这条新链称为随后链。这种领头链是连续合成，随后链是断续合成的方式称 为半不连续复制（semidiscontinuous replication）。原核细胞冈崎片段长度约为 1 000～2 000 个核苷酸。真核细胞的较短，长度约 100～200 个核苷酸。 图 10-11 DNA 的双向复制 尽管领头链的合成总是领先一段，但是从来没有发现领头链跑得太远，而总是与随 后链保持相对稳定的一段距离。1988 年 Kornberg 等人从大肠杆菌中分离出 800kDa 的 pol Ⅲ*和 900kDa 的 pol Ⅲ全酶，其中各个亚基均有两个，并证明是具有双活性部位的非对 称结构，这表明同一个 pol Ⅲ全酶可能同时负责领头链和随后链的复制。根据实验资料 提出如下复制模型（图 10-12），随后链的模板在 DNA 聚合酶Ⅲ全酶上绕转 180 度形成一 个小环，使冈崎片断的合成方向能够与领头链的合成方向以及复制体的移动方向保持一 致。随着冈崎片断的延长，这个大环从 DNA 聚合酶Ⅲ上释放。在此之前，领头链的合成 已将另一部分随后链的模板置换出来，并在适于引发的位点上由引发体合成新的引物