第三章酶通论 酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是该酶迄今未 发现的新的活力类型的活力中心。 酶分子很大,其催化作用往往并不需要整个分子,如用氨基肽酶处理 木瓜蛋白酶,其肽链自N端开始逐渐缩短,当其原有的180个氨基酸残基 被水解掉120个后,剩余的短肽仍有水解蛋白质的活性。又如将核糖核酸 酶肽链C末端的三肽切断,余下部分也有酶的活性,足见某些酶的催化活 性仅与其分子的一小部分有关。 不同的酶有不同的活性中心,故对底物有严格的特异性。 活性中心外必需基团 结合基团 作用物分子 催化基团 酶活性中心示意图 二)酶活性中心证明方法 1.切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩 余的肽链仍有活性,说明切除的肽链与活性无关,反之,切除的肽链与活 性有关 2化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引 起共价结合、氧化或还原等修饰,称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的 基团有:-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等,用作修饰的试剂很多, 目前已有七十多种,但专一性的修饰剂不多 判断方法:某一基团被修饰后,酶的活性显著下降或无活性,可初步 判断该基团与酶的活性有关;反之,与酶的活性无关。 缺点:也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶 分子的正常空间结构,而导致酶活性的丧失。为排除这种可能,常在底物 保护下用同一试剂对酶作用,若不能被修饰,说明该基团确实处于活性部
第三章 酶通论 6 酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是该酶迄今未 发现的新的活力类型的活力中心。 酶分子很大，其催化作用往往并不需要整个分子，如用氨基肽酶处理 木瓜蛋白酶，其肽链自 N 端开始逐渐缩短，当其原有的 180 个氨基酸残基 被水解掉 120 个后，剩余的短肽仍有水解蛋白质的活性。又如将核糖核酸 酶肽链 C 末端的三肽切断，余下部分也有酶的活性，足见某些酶的催化活 性仅与其分子的一小部分有关。 不同的酶有不同的活性中心，故对底物有严格的特异性。 酶活性中心示意图 二） 酶活性中心证明方法 1.切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩 余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活 性有关。 2.化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引 起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的 基团有：-SH、-OH、咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多， 目前已有七十多种，但专一性的修饰剂不多。 判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步 判断该基团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。 缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶 分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物 保护下用同一试剂对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部
第三章酶通论 位;反之,底物存在下,该基团可被同一试剂修饰,且使酶失活,在则该 基团不是活性部位的基团,而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团,化学修饰可分 为 (1)、非特异性共价共接修饰:修饰试剂既可与酶的活性部位的某特 异基团结合,又可与酶的非活性部位的同一基团结合,称之为非特异性共 价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位,在非活性部位不存在或 极少存在。判断标准是一:酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比;二 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。 (2)、特异性的共价修饰:修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特 定基团,使酶失活。如:DIFP(二异丙基氟磷酸)可专一性地结合丝氨酸 蛋白酶活性部位的丝氨酸一OH而使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应, 也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应,只与活性的酶且活性部位含 丝氨酸的酶结合。 3亲和标记法: 根据酶与底物能特异性的结合的性质,设计合成一种含反应基团的底 物类似物,作为活性部位的标记试剂,它能象底物一样进入酶的活性部位, 并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合,使酶失 去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为:N一对甲苯磺酰一L一苯丙氨酰乙酯 或甲酯,根据此结构设计的亲和标记试剂为:N一对甲苯磺酰一苯丙氨酰氯 甲基酮(TPCK)。 4X一射线衍射法:把一纯酶的ⅹ一射线晶体衍射图谱与酶与底物反应 后的Ⅹ-射线图谱相比较,即可确定酶的活性中心。 5基因定位突变法 如果用同位素标记酶的活性中心后,将酶水解,分离带标记水解片段, 对其进行一级结构测定,就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白 水解酶进行类似的分析,功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性 活性部位的一般特点 ①只占酶整个体积的相当小的一部分;②是一个三维实体(立体空间) ③多是裂隙、裂缝或凹穴;④多数底物与酶结合时通过弱的作用力;⑤结
第三章 酶通论 7 位；反之，底物存在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该 基团不是活性部位的基团，而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分 为： （1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特 异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共 价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或 极少存在。判断标准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二： 底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。 （2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特 定基团，使酶失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸 蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH 而使酶失活。DIFP 一般不与蛋白质反应， 也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含 丝氨酸的酶结合。 3.亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底 物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位， 并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失 去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯 或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对甲苯磺酰—苯丙氨酰氯 甲基酮（TPCK）。 4.X－射线衍射法：把一纯酶的 X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应 后的 X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。 5.基因定位突变法 如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段， 对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。对各种蛋白 水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性。 活性部位的一般特点： ①只占酶整个体积的相当小的一部分；②是一个三维实体（立体空间）； ③多是裂隙、裂缝或凹穴；④多数底物与酶结合时通过弱的作用力；⑤结
第三章酶通论 合的专一性决定于活性中心的原子基团的正确排列,并且活性中心是柔性 的 、酶原激活 酶以酶原的形式合成和分泌,酶原是没有活性的酶的前体。使无活性 的酶原转变成活性酶的过程,称为酶原激活。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜 蛋白酶、羧基肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式 存在,在一定条件下才转化成相应的酶。酶原激活的实质是活性部位形成 或暴露的过程。 例如,胰蛋白酶原进入小肠后,受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活,第6 位赖氨酸与第7位异亮氨酸残基之间的肽键被切断,水解掉一个六肽,酶 分子空间构象发生改变,产生酶的活性中心,于是胰蛋白酶原变成了有活 性的胰蛋白酶。除消化道的蛋白酶外,血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的 酶类,也都以酶原的形式存在。酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生 的蛋白酶对细胞进行自身消化,并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用, 保证体内代谢的正常进行。 四、重要的酶 (一)同工酶 1.同工酶( isoenzyme)是指催化的化学反应相同,酶蛋白的分子结构、 理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或 同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。 现已发现有数种同工酶。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性 和碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酸、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、 过氧化酶和胆碱酯酶等。其中糖酵解过程中的关键酶之一乳酸脱氢酶最为 熟悉,乳酸脱氢酶(LDH)有五种同工酶,它们的分子量在130000-15000 范围内,都由四个亚基组成。LDH的亚基可以分为两型(由2种不同的结 构基因编码成的2种蛋白质亚基),即:骨骼肌型(M型)和心肌型(H型)。 M、H亚基的氨基酸组成有差别,可用电泳分离。其免疫抗体无交叉反应。 两种亚基以不同比例组成五种四聚体即为一组LDH同工酶LDH5(M4) LDH4(M3H)、LDH(M2H2)、LDH2(MH3)和LDH1(H4)电泳时都移向正极, 其速度以LDH1为最快,依次递减,以LDH5为最慢。若用12M尿素或5M
第三章 酶通论 8 合的专一性决定于活性中心的原子基团的正确排列，并且活性中心是柔性 的。 三、酶原激活 酶以酶原的形式合成和分泌，酶原是没有活性的酶的前体。使无活性 的酶原转变成活性酶的过程，称为酶原激活。胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜 蛋白酶、羧基肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式 存在，在一定条件下才转化成相应的酶。酶原激活的实质是活性部位形成 或暴露的过程。 例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第 6 位赖氨酸与第 7 位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶 分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活 性的胰蛋白酶。除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的 酶类，也都以酶原的形式存在。酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生 的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环境中发挥作用， 保证体内代谢的正常进行。 四、重要的酶 （一）同工酶 1.同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、 理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或 同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。 现已发现有数种同工酶。如 6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性 和碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酸、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、 过氧化酶和胆碱酯酶等。其中糖酵解过程中的关键酶之一乳酸脱氢酶最为 熟悉，乳酸脱氢酶(LDH)有五种同工酶，它们的分子量在 130000～150000 范围内，都由四个亚基组成。LDH 的亚基可以分为两型（由 2 种不同的结 构基因编码成的 2 种蛋白质亚基），即：骨骼肌型(M 型)和心肌型(H 型)。 M、H 亚基的氨基酸组成有差别，可用电泳分离。其免疫抗体无交叉反应。 两种亚基以不同比例组成五种四聚体即为一组 LDH 同工酶 LDH5(M4)、 LDH4(M3H) 、LDH3(M2H2)、LDH2(M H3)和 LDH1(H4)。电泳时都移向正极， 其速度以 LDH1 为最快，依次递减，以 LDH5 为最慢。若用 12M 尿素或 5M
第三章酶通论 盐酸胍溶液处理,M亚基和H亚基可以分开,但此时LDH无酶的活性, 其结构示意如下: 888888888 为M系 魄H四聚体 HMMM纯M四体 同工酶的生物学功能: 同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化 和癌变的有力工具。在酶学、生物学和医学中均占有重要地位 2.变构酶与变构调节 有些酶除了活性中心外,还有一个或几个部位,当特异性分子非共价 结合到这些部位时,可改变酶的构象,进而改变酶的活性,酶的这种调节 作用称为变构调节(allosteric regulation),受变构调节的酶称变构酶( allosteric enzyme),也称为别构酶,这些特异性分子称为效应剂( effector)。变构酶分 子组成,一般是多亚基的,分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部 位( catalytic site),凡与效应剂相结合的部位称为调节部位( regulatory site), 这二部位可以在不同的亚基上,或者位于同一亚基。 变构酶多为寡聚酶,含的亚基数一般为偶数;且分子中有催化部位(结 合底物)与调节部位(结合变构剂),这两部位可以在不同的亚基上,或 者在同一亚基的两个不同部位 (1)作用机理点 1)、一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚 基上的活性中心结合后,通过构象的改变,可增强其他亚基的活性中心与 底物的结合,出现正协同效应( positive cooperative effect)。使其底物浓度曲 线呈S形。即底物浓度低时,酶活性的増加较慢,底物浓度髙到一定程度 后,酶活性显著加强,最终达到最大值Vmax 多数情况下,底物对其变构酶的作用都表现正协同效应,但有时一个 底物与一个亚基的活性中心结合后,可降低其他亚基的活性中心与底物的 结合,表现负协同效应( negative cooperative effect)如3-磷酸甘油醛脱氢酶 对NAD的结合为负协同效应
第三章 酶通论 9 盐酸胍溶液处理，M 亚基和 H 亚基可以分开，但此时 LDH 无酶的活性， 其结构示意如下： 同工酶的生物学功能： 同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化 和癌变的有力工具。在酶学、生物学和医学中均占有重要地位。 2. 变构酶与变构调节 有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价 结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节 作用称为变构调节(allosteric regulation)，受变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme)，也称为别构酶，这些特异性分子称为效应剂(effector)。变构酶分 子组成，一般是多亚基的，分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部 位(catalytic site)，凡与效应剂相结合的部位称为调节部位(regulatory site)， 这二部位可以在不同的亚基上，或者位于同一亚基。 变构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结 合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或 者在同一亚基的两个不同部位。 （1）作用机理/特点 1)、 一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚 基上的活性中心结合后，通过构象的改变，可增强其他亚基的活性中心与 底物的结合，出现正协同效应(positive cooperative effect)。使其底物浓度曲 线呈 S 形。即底物浓度低时，酶活性的增加较慢，底物浓度高到一定程度 后，酶活性显著加强，最终达到最大值 Vmax。 多数情况下，底物对其变构酶的作用都表现正协同效应，但有时一个 底物与一个亚基的活性中心结合后，可降低其他亚基的活性中心与底物的 结合，表现负协同效应(negative cooperative effect)。如 3-磷酸甘油醛脱氢酶 对 NAD+的结合为负协同效应
第三章酶通论 2)、正协同效应的变构酶其速度一底物浓度曲线呈S形,即底物浓度 较低时,酶活性的增加缓慢,底物浓度高到一定程度后,酶活性显著加强, 最终达到最大值Vmax。如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶( ATCase) 对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应;负协同效应的变构酶其速度 底物浓度曲线为类似双曲线,底物浓度较低时,酶表现出较大活性,但底 物浓度明显增加时,其反应速度无明显变化。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对 NAD+的结合为负协同效应,其意义在于无论细胞内酶的底物浓度如何变 化,酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要 3)、变构酶除活性中心外,存在着能与变构剂作用的亚基或部位,称 调节亚基(或部位),变构剂与调节亚基以非共价键特异结合,可以改变调节 亚基的构象,进而改变催化亚基的构象,从而改变酶活性。凡使酶活性增 强的变构剂称变构激活剂 (allosteric activitor)),它能使上述S型曲线左移, 饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的 变构剂称变构抑制剂( allosteric inhibitor),能使S形曲线右移。例如,ATP 是磷酸果糖激酶的变构抑制剂,而ADP、AMP为其变构激活剂 4)、由于变构酶动力学不符合米一曼氏酶的动力学,所以当反应速度 达到最大速度一半时的底物的浓度,不能用Km表示,而代之以K0.5S表 (2)变构酶除活性中心外,存在着能与效应剂作用的亚基或部位, 称调节亚基(或部位),效应剂与调节亚基以非共价键特异结合,可以改变调 节亚基的构象,进而改变催化亚基的构象,从而改变酶活性。凡使酶活性 增强的效应剂称变构激活剂( allo steric activ itor),它能使上述S型曲线左移。 凡使酶活性减弱的效应剂称变构抑制剂( allosteric inhibitor),能使S形曲线 右移。例如,ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂,而ADP、AMP为其变构 激活剂。 (3)变构酶生理意义 )在变构酶的S形曲线中段,底物浓度稍有降低,酶的活性明显下降, 多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭;反之,底物浓度稍有升高,则 酶活性迅速上升,代谢通路又被打开,因此可以快速调节细胞内底物浓度 和代谢速度。2)变构抑制剂常是代谢通路的终产物,变构酶常处于代谢通 路的开端,通过反馈抑制,可以及早地调节整个代谢通路,减少不必要的
第三章 酶通论 10 2）、正协同效应的变构酶其速度—底物浓度曲线呈 S 形，即底物浓度 较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强， 最终达到最大值 Vmax。 如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase） 对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应；负协同效应的变构酶其速度— 底物浓度曲线为类似双曲线，底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但底 物浓度明显增加时，其反应速度无明显变化。如 3-磷酸甘油醛脱氢酶对 NAD+的结合为负协同效应，其意义在于无论细胞内酶的底物浓度如何变 化，酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要。 3）、变构酶除活性中心外，存在着能与变构剂作用的亚基或部位，称 调节亚基(或部位)，变构剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调节 亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增 强的变构剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述 S 型曲线左移， 饱和量的变构激活剂可将 S 形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的 变构剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使 S 形曲线右移。例如，ATP 是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而 ADP、AMP 为其变构激活剂。 4）、由于变构酶动力学不符合米－曼氏酶的动力学，所以当反应速度 达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用 Km 表示，而代之以 K0.5S 表 示。 （2） 变构酶除活性中心外，存在着能与效应剂作用的亚基或部位， 称调节亚基(或部位)，效应剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调 节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性 增强的效应剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述 S 型曲线左移。 凡使酶活性减弱的效应剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使 S 形曲线 右移。例如，ATP 是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而 ADP、AMP 为其变构 激活剂。 （3）变构酶生理意义 1) 在变构酶的 S 形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降， 多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则 酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以快速调节细胞内底物浓度 和代谢速度。2) 变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通 路的开端，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的