30个循环,可达230≈109个分子 介于两个引物之间的DNA片段有: 25~30个 230-2×30≈109个分子。 循环 logon Y=X(1+e)", e:扩增效率(平均为75%) n:循环次数 Cycles PCR产物生成曲线
PCR产物生成曲线 log[DNA] Cycles 25~30个 循环 30个循环，可达2 30≈109个分子 介于两个引物之间的DNA片段有： 2 30﹣2×30 ≈109个分子。 Y=X(1+e)n ， e: 扩增效率(平均为75%) n: 循环次数
PCR反应体系和反应条件 模板DNA >寡聚核苷酸引物(一对) 热稳定的DNA聚合酶 4 pdnTP (datP, dGTP, dCtP, dTTP) 合适的缓冲液系统 >总体积(20-100μ)
模板DNA 寡聚核苷酸引物（一对） 热稳定的DNA聚合酶 4种dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） 合适的缓冲液系统 三. PCR反应体系和反应条件 总体积（20~100 L）
模板DNA 模板用量很低 102~104拷贝已足够,一般100 ng dna模板/100μL。 对纯度、完整性要求不高 标准的分子生物学方法制备 避免交叉污染和影响PCR反应的杂质污染、避免模板降解 (蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等) 样本来源广泛 可以是DNA(双链,单链均可),也可以是RNA,甚至完整组织细胞 可以线性,也可以环状,以线性模板的扩增效率为高
模板DNA 模板用量很低 102~104拷贝已足够，一般100ng DNA模板/100L。 对纯度、完整性要求不高 标准的分子生物学方法制备 避免交叉污染和影响PCR反应的杂质污染、避免模板降解 （蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等） 样本来源广泛 可以是DNA（双链，单链均可），也可以是RNA，甚至完整组织细胞 可以线性，也可以环状，以线性模板的扩增效率为高
寡聚核苷酸引物(一对)影擦率 决定扩增产物的大小及其在基因组中的位置 5端引物:上游/正义/+”链引物 3端引物:下游反义-”链引物 引物浓度一般为01~0.5moL(6×1012~6×1013个分子) 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 引物和基因组靶序列的摩尔比至少为108:1
寡聚核苷酸引物（一对） 决定扩增产物的大小及其在基因组中的位置 5′端引物：上游/正义/“﹢”链引物 3′端引物：下游/反义/“﹣”链引物 影响扩增效率与特 异性的最关键因素 引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L（6×1012~ 6×1013个分子） 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 引物和基因组靶序列的摩尔比至少为108∶1
PCR引物设计的原则 引物设计的最大原则是: 最大限度地提高扩增效率和特异性; 同时尽可能减少非特异性扩增
PCR引物设计的原则 引物长度：一般15-30 nt，常用为20 nt左右 引物扩增跨度：最适200~500bp 引物成分： 避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积，尤其3′端不应超过3个连续的G或C G+C含量：40~60% 两引物具有相近的Tm值且无互补序列 引物内不会形成二级结构 引物设计的最大原则是： 最大限度地提高扩增效率和特异性； 同时尽可能减少非特异性扩增