第十二章生物技术在园艺植物上的应用生物技术是指在离体条件下，人为地使植物细胞或组织繁殖增长，产生一些次生代通物质，以及对生物体进行遗传修饰的各项技术的总称。广义的生物技术包括生物技术在园艺植物育种上的应用研究，近年来，取得了较大的进展，显示出巨大的潜力，例如，采用离体培养方法快速繁殖园艺植物苗木；胚培养，胚乳培养，花药与花翰培养，以及原生质体操作，培育果树新品种等等。本章择要介绍生物技术应用于园艺植物品种选育或良种繁育中富有成效或潜力的若干领域。第一节组织及器官培养组织培养是生物技术中的一个基本技术。植物组织培养就是从植物体上取下某一器官或组织，在人工培养基上分化、再分化，最后长成完整植株的过程。近年来，园艺的组织培养研究工作发展较快，在许多方面取得了新研究进展，特别在科学研究和生产实践中显示出重要的作用。例如组织培养产生的新个体能消除营养繁殖类型的病毒病；能够加快繁殖良种苗木；通过胚乳培养能获得三倍体无核果实；花粉培养能获得纯合亲本，有助于控制后代的遗传；单细胞和原生质体的培养，有助于解决嵌合体对突变育种的干扰；通过组织培养与诱变育种相结合，可为果树育种开辟新的育种途径等等。从1902年德国的Haberland开始培养植物的叶肉组织算起，植物组织培养已有90年的历史。当时他提出一个大胆的设想：从一个体细胞可以得到人工培养的胚，即细胞的”全能性“问题。”全能性”是指离体的植物细胞或性细胞（花粉）在一定培养条件下，能被诱导发生器官分化和再生成植株的能力，而且再生植株具有于母体植株相同的全部遗传信息。组织培养的原理就在于细胞的全能性。通过组织培养巧妙的利用这种全能性，使其在各方面取得成效。可以预期，细胞全能性的进一步开发和利用，可望创造更多的新品种，并在改良现有品种的过程中，大大节约时间和空间。一.果树组织培养的研究概况园艺植物特别是果树品种改良过去多采用常规技术，但选择效率低，育种周期太长，已不能满足生产的需要。近年来迅速发展的生物技术为改良果树品种开辟了一条新途径。随着组织培养技术的不断改进和日臻完善，特别是基因工程和细胞工程的兴起，不仅可以克服常规育种历来存在的某些障碍，而且可以获得常规育种难以或无法得到的新基因型，从而可以创造出新的品种或物种。应用生物技术改良植物品种的研究范围较广，这里仅从组织培养和生物技术的实际应用两部分作一介绍。组织培养是生物技术的重要工具，世界各国都很重视，开展了多方面的研究。至今，美国、英国、意大利、法国、原苏联、澳大利亚等国，以及我国的北京、上海、辽宁、山东、山西、河南、河北、江苏、浙江、广东、福建、甘肃、宁夏、新疆等省、市、自治区，都开展了果树和瓜类组织培养研究工作，涉及范围很广，几乎所有主要果树和瓜类都进行过组织培养研究，并且成效显著。例如，茎尖培养用来快速繁殖品种苗木，已在苹果品种、苹果矮化砧木及梨、桃、李、葡萄、扁桃、樱桃、板栗、核桃、猕猴桃、柑桔、草莓和西瓜上得到应用：并且已在苹果、柑桔和草莓上获得无病毒植株，同时利用试管苗的微型嫁接技术消除了柑桔病毒。通过培乳培养以获得三倍体植株的工作，已在苹果、猕猴桃、柑桔、枇杷、柚子、葡萄、桃、枣、梨上开展，其中苹果、柑桔、称猴桃已获得三倍体植株。胚珠培养的目的在于克服种子休眠及缩短育种周期，克服远缘杂交中杂种胚的败育等问题，尤其在桃上应用较多，其它如苹果、梨、柑桔、山楂、李、杏、樱桃和西瓜上均获得了成功。胚珠培养在柑桔上得到了植株。花药培养是为了获得单倍体植株，在苹果、草每、葡萄、梨、桃、否、柑桔、枇杷、西瓜上获得厂成功。器官培养中有叶培养、胚轴培养、果肉培养、汗汁囊培养、子叶培养、茎段培养等都获得了成功。如日本用樱桃叶、葡萄叶培养得到了生根植株，有人用石榴叶培养也得到了成功。原生质体培养，在柑桔、狱称猴桃、苹果上已获得成功，细胞融合杂交，日本国立果树试验场用桃细胞间杂交，已获得融合细胞：日本安艺津果树农场用枸桔和甜橙属间细胞杂交，培育出细胞融合的杂种植株，已移入温室，镜检证明为四倍体。组织培养还用于种质保存和抗盐性育种等方面。二，组织培养的实际应用包括的内容较多，其主要方面有以下几点：1无性系变异的诱导与选择：无性系变异包括体细胞无性系和配子无性系两个方面。通常情况下，要获得无性系变异，关键在于诱导不定芽或无性胚的发生。果树作物诱导不定芽或无性胚比较困难。自从陈维伦（1979）利用苹果砧木M9茎段愈伤组织诱导获得新梢后，这方面逐渐取得了较大进展。一般情况下，利用果树茎尖进行离体繁殖的过程中，可能发生基因的突变，尤其是利用愈伤组织诱导新梢的过程，可以显著提高突变频率。因此，组织培养本身往往就是新的意想不到的遗传变异的丰富来源。除了在组织培养过程中，无性系自然变异外，人们有意识地在培养过程中加入某种诱变条件，大大提高了变异频率。傅润民等（1990）用苹果、葡萄试管苗茎尖进行C060射线处理，找出了适宜的处理方法。张德民等（1990）用山楂茎尖进行射线处理，通过对继代培养的一代和二代材料的酯酶电泳分析，认为同工酶可作用鉴别突变的指标。郑永年等（1988）在草莓上也用类似方法获得了草莓的同质突变体。英国东茂林试验站，在诱导苹果叶片再生新梢前用X射线进行照射处理，将再生新梢形成的植株栽植田间进行观察，但尚未见到有明显变异。日本将秋水仙素加入培养基诱发葡萄变异，已得到生根的变异植株。试验体系。2.原生质体培养和细胞融合：
第十二章 生物技术在园艺植物上的应用 生物技术是指在离体条件下，人为地使植物细胞或组织繁殖增长，产生一些次生代通物质，以及 对生物体进行遗传修饰的各项技术的总称。广义的生物技术包括 生物技术在园艺植物育种上的应用研究，近年来，取得了较大的进展，显示出巨大的潜力，例如， 采用离体培养方法快速繁殖园艺植物苗木；胚培养，胚乳培养，花药与花翰培养，以及原生质体操作，培育果树新 品种等等。 本章择要介绍生物技术应用于园艺植物品种选育或良种繁育中富有成效或潜力的若干领域。 第一节组织及器官培养 组织培养是生物技术中的一个基本技术。植物组织培养就是从植物体上取下某一器官或组织，在人工培 养基上分化、再分化，最后长成完整植株的过程。 近年来，园艺的组织培养研究工作发展较快，在许多方面取得了新研究进展，特别在科学研究和生产实 践中显示出重要的作用。例如组织培养产生的新个体能消除营养繁殖类型的病毒病；能够加快繁殖良种苗木；通过 胚乳培养能获得三倍体无核果实；花粉培养能获得纯合亲本，有助于控制后代的遗传；单细胞和原生质体的培养， 有助于解决嵌合体对突变育种的干扰；通过组织培养与诱变育种相结合，可为果树育种开辟新的育种途径等等。 从1902年德国的Haberland开始培养植物的叶肉组织算起，植物组织培养已有90年的历史。当时他提出一 个大胆的设想：从一个体细胞可以得到人工培养的胚，即细胞的"全能性"问题。 "全能性"是指离体的植物细胞或 性细胞（花粉）在一定培养条件下，能被诱导发生器官分化和再生成植株的能力，而且再生植株具有于母体植株相 同的全部遗传信息。组织培养的原理就在于细胞的全能性。通过组织培养巧妙的利用这种全能性，使其在各方面取 得成效。 可以预期，细胞全能性的进一步开发和利用，可望创造更多的新品种，并在改良现有品种的过程中，大 大节约时间和空间。 一.果树组织培养的研究概况 园艺植物特别是果树品种改良过去多采用常规技术，但选择效率低，育种周期太长，已不能满足生产的 需要。近年来迅速发展的生物技术为改良果树品种开辟了一条新途径。随着组织培养技术的不断改进和日臻完善， 特别是基因工程和细胞工程的兴起，不仅可以克服常规育种历来存在的某些障碍，而且可以获得常规育种难以或无 法得到的新基因型，从而可以创造出新的品种或物种。 应用生物技术改良植物品种的研究范围较广，这里仅从组织培养和生物技术的实际应用两部分作一介绍。 组织培养是生物技术的重要工具，世界各国都很重视，开展了多方面的研究。至今，美国、英国、意大 利、法国、原苏联、澳大利亚等国，以及我国的北京、上海、辽宁、山东、山西、河南、河北、江苏、浙江、广 东、福建、甘肃、宁夏、新疆等省、市、自治区，都开展了果树和瓜类组织培养研究工作，涉及范围很广，几乎所 有主要果树和瓜类都进行过组织培养研究，并且成效显著。例如，茎尖培养用来快速繁殖品种苗木，已在苹果品 种、苹果矮化砧木及梨、桃、李、葡萄、扁桃、樱桃、板栗、核桃、猕猴桃、柑桔、草莓和西瓜上得到应用；并且 已在苹果、柑桔和草莓上获得无病毒植株，同时利用试管苗的微型嫁接技术消除了柑桔病毒。通过培乳培养以获得 三倍体植株的工作，已在苹果、猕猴桃、柑桔、枇杷、柚子、葡萄、桃、枣、梨上开展，其中苹果、柑桔、猕猴桃 已获得三倍体植株。胚珠培养的目的在于克服种子休眠及缩短育种周期，克服远缘杂交中杂种胚的败育等问题，尤 其在桃上应用较多，其它如苹果、梨、柑桔、山楂、李、杏、樱桃和西瓜上均获得了成功。胚珠培养在柑桔上得到 了植株。花药培养是为了获得单倍体植株，在苹果、草莓、葡萄、梨、桃、杏、柑桔、枇杷、西瓜上获得了成功。 器官培养中有叶培养、胚轴培养、果肉培养、汁囊培养、子叶培养、茎段培养等都获得了成功。如日本用樱桃叶、 葡萄叶培养得到了生根植株，有人用石榴叶培养也得到了成功。原生质体培养，在柑桔、猕猴桃、苹果上已获得成 功，细胞融合杂交，日本国立果树试验场用桃细胞间杂交，已获得融合细胞；日本安艺津果树农场用枸桔和甜橙属 间细胞杂交，培育出细胞融合的杂种植株，已移入温室，镜检证明为四倍体。组织培养还用于种质保存和抗盐性育 种等方面。 二.组织培养的实际应用 包括的内容较多，其主要方面有以下几点： 1无性系变异的诱导与选择： 无性系变异包括体细胞无性系和配子无性系两个方面。通常情况下，要获得无性系变异，关键在于诱导不 定芽或无性胚的发生。果树作物诱导不定芽或无性胚比较困难。自从陈维伦（1979）利用苹果砧木M9茎段愈伤组织 诱导获得新梢后，这方面逐渐取得了较大进展。 一般情况下，利用果树茎尖进行离体繁殖的过程中，可能发生基因的突变，尤其是利用愈伤组织诱导新梢 的过程，可以显著提高突变频率。因此，组织培养本身往往就是新的意想不到的遗传变异的丰富来源。 除了在组织培养过程中，无性系自然变异外，人们有意识地在培养过程中加入某种诱变条件，大大提高了 变异频率。傅润民等（1990）用苹果、葡萄试管苗茎尖进行CO60 射线处理，找出了适宜的处理方法。张德民等 （1990）用山楂茎尖进行射线处理，通过对继代培养的一代和二代材料的酯酶电泳分析，认为同工酶可作用鉴别突 变的指标。郑永年等（1988）在草莓上也用类似方法获得了草莓的同质突变体。英国东茂林试验站，在诱导苹果叶 片再生新梢前用X射线进行照射处理，将再生新梢形成的植株栽植田间进行观察，但尚未见到有明显变异。日本将 秋水仙素加入培养基诱发葡萄变异，已得到生根的变异植株。 试验体系。 2.原生质体培养和细胞融合：
植物原生质体由于没有细胞壁的物理障碍，可以摄入大分子和细胞器，对导入外源遗传物质极为有利，而且原生质体可以再生植株，这就为离体筛选突变体、人工诱导避免产生嵌合体、细胞融合及遗传转化等提供了良好的试验体系。果树原生质体培养获得再生植株的落叶果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和杏等。常绿果树主要是柑桔类研究较多。AnitaWallin和LarsJonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583XMclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培养获得苹果再生植株。E.M.Patat-0chatt等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.0chatt等（1988）先后利用野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Colt樱桃组培苗叶片原生质体、Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生植株。M.M.01iveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再生植株。Button等（1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状体，后来得到了再生植株（Vardi，J977；Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原生质体再生植株。利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。。Ohg一awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属积的体细胞杂种。随后Vardi等（1987）和Grosser等（1987：1988b，1988c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。目前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植株，经染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。3.染色体工程技术染色体是遗传基因的载体，一直受到研究者们的重视。随着组织培养技术的发展，已在多种果树上获得了单倍体、多倍体和非整倍体植株。我国在果树上通过花药培养获得单倍体的研究已走在了世界前列。目前已获得了苹果、葡萄、子、柑桔、荔枝、龙眼等花粉植株。有了这些纯系，就可准确地选配亲本进行杂交，并提高对杂种后代的预见性。就可进行品种间杂交，或直接利用纯系间的杂种优势。多倍体可以通过组织培养、化学诱变，有性杂交及细胞融合等途径获得。在果树上，黄贞光等（1982)用猕猴桃胚乳培养获得了胚乳植株，经鉴定证明是三倍体，2n=3x=87.毋锡金等（1981)培养金冠、红玉苹果的胚乳获得了植株，经鉴定，根尖细胞染色体数多于35的非整倍体细胞十分普遍，而有三倍染色体的细胞不多见（约2%3%）。赵惠详等用锦丰架胚乳培养得到了植株，经鉴定，细胞染色体倍数性极不稳定，是由多种染色体数目的细胞组成的嵌合体。王大元（1978)用柑桔、孟新法（1981)用桃也得到了胚乳植株。石荫坪等（1986，1987)用秋水仙碱试管诱变苹果7个二倍体品种自然授粉的胚，通过离体分化培养，获得了植株，经鉴定得到24个稳定的四倍体株系，部分植株已移入果园。4.基因工程技术把从细胞中分离出来的基因，经纯化后直接使用，或用化学物质，或用酶人为地使之发生变化，形成新的遗传信息，然后再将其导入到细胞中，得到具有新的遗传信息的细胞，这种基因工程技术是目前生物技术研究的一个热点。据报道，现已提取出抗病毒、抗虫、抗冻、抗除草剂、矮化及固氮等基因。基因导人，通常有两种方法：一种是将外源DNA片断直接引入细胞中，如利用基因枪或利用授粉后花粉管的通道将DNA片断直接注入。另一种是用农杆菌作基因载体，将外源基因导人细胞中。在果树上，已有的研究报道多采用后一种方法。就世界范围来看，果树的基因转移研究，美国、新西兰开展较多，其次是英国、加拿大等国。目前已经在核桃、桃、李、猕猴桃、苹果、草莓、葡萄、番木瓜、扁桃等树种上成功地获得了转基因植株。Ca!eHMcgranah等（1988)用核桃无性胚接种带有PCGN200,594质粒的农杆菌，得到了世界上第一个来自无性胚的转基因植株。AbhayaM.Dadekar等（1988)用几个核桃品种及其杂种一代的微繁无性系，接种带有PTiAb和PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。R.Scorza等（1991)用带有复合质粒的农杆菌6044接种桃的叶片和胚愈伤组织，得到了转基因植株。F.A.Hanmerschlag等（1989)报道了用桃原生质体和叶等幼嫩组织作基因转移的情况，随后又用微繁的桃嫩茎接种带有PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。S.Mante等（1990)用李的下胚轴切片，接种带有PCGH7001或PCGH7314质粒的农杆菌，得到了转基因植株。新西兰从一种小果实的红肉猕猴桃中分离，提取出控制红肉的基因，然后转移到大果品种中，现已得到了一个果重708以上的红肉猕猴桃，这是世界上第一个有实用价值的转基因果树。除此之外，新西兰还在苹果上从事控制成熟期基因的研究。D.J.James等（1989)在世界上第一个得到了苹果转基因植株，其他学者在苹果砧木，樱桃上还试验了能产生瘤的标记基因转移，均得到了转基因瘤个体。在梨上也得到了同样结果。NarenderS.Nehra等（1990）和G.Jclenkovic等（1990）分别用草莓叶片和茎节切片、胚轴作材料，接种带有P81121和PGV3850：1103质粒的农杆菌，均得到了转基因植株。T.J.Baribault等（1989)用葡萄悬浮细胞与带有PGV3850:1103质粒混合体，或带有双体媒介PGA474-68质粒的农杆菌，进行共培样，均得到了对卡拉霉索具有抗性的组织，并已证实是稳定结合和表达
植物原生质体由于没有细胞壁的物理障碍，可以摄入大分子和细胞器，对导入外源遗传物质极为有利，而且 原生质体可以再生植株，这就为离体筛选突变体、人工诱导避免产生嵌合体、细胞融合及遗传转化等提供了良好的 试验体系。 果树原生质体培养获得再生植株的落叶果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和杏等。常绿果树 主要是柑桔类研究较多。 Anita Wallin和Lars Jonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583 X Mclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培 养获得苹果再生植株。E .M. Patat-Ochatt 等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种 勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.Ochatt等（1988）先后利用 野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Colt樱桃组培苗叶片原生质体、 Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。 蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生 植株。M.M.Oliveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再 生植株。 Button等(1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。 Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状 体，后来得到了再生植株( Vardi，]977； Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原 生质体再生植株。 利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。 Ohg—awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属枳的体细 胞杂种。随后Vardi等(1987)和Grosser等(1987；1988 b，1988 c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。目 前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金 柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植株，经 染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。 3．染色体工程技术 染色体是遗传基因的载体，一直受到研究者们的重视。随着组织培养技术的发展，已在多种果树上获得了单倍 体、多倍体和非整倍体植株。 我国在果树上通过花药培养获得单倍体的研究已走在了世界前列。目前已获得了苹果、葡萄、揪子、柑 桔、荔枝、龙眼等花粉植株。有了这些纯系，就可准确地选配亲本进行杂交，并提高对杂种后代的预见性。就可进 行品种间杂交，或直接利用纯系间的杂种优势。 多倍体可以通过组织培养、化学诱变，有性杂交及细胞融合等途径获得。在果树上，黄贞光等(1982)用猕 猴桃胚乳培养获得了胚乳植株，经鉴定证明是三倍体，2 n=3 x=87．毋锡金等(1981)培养金冠、红玉苹果的胚乳获 得了植株，经鉴定，根尖细胞染色体数多于35的非整倍体细胞十分普遍，而有三倍染色体的细胞不多见(约2％一 3％)。赵惠详等用锦丰梨胚乳培养得到了植株，经鉴定，细胞染色体倍数性极不稳定，是由多种染色体数目的细胞 组成的嵌合体。王大元(1978)用柑桔、孟新法(1981)用桃也得到了胚乳植株。石荫坪等(1986，1987)用秋水仙碱试 管诱变苹果7个二倍体品种自然授粉的胚，通过离体分化培养，获得了植株，经鉴定得到24个稳定的四倍体株系， 部分植株已移入果园。 4．基因工程技术 把从细胞中分离出来的基因，经纯化后直接使用，或用化学物质，或用酶人为地使之发生变化，形成新的遗传信 息，然后再将其导入到细胞中，得到具有新的遗传信息的细胞，这种基因工程技术是目前生物技术研究的一个热 点。据报道，现已提取出抗病毒、抗虫、抗冻、抗除草剂、矮化及固氮等基因。基因导人，通常有两种方法：一种 是将外源DNA片断直接引入细胞中，如利用"基因枪"或利用授粉后花粉管的通道将DNA片断直接注入。另一种是用农 杆菌作基因载体，将外源基因导人细胞中。在果树上，已有的研究报道多采用后一种方法。就世界范围来看，果树 的基因转移研究，美国、新西兰开展较多，其次是英国、加拿大等国。目前已经在核桃、桃、李、猕猴桃、苹果、 草莓、葡萄、番木瓜、扁桃等树种上成功地获得了转基因植株。 Ca!e H Mcgranah 等(1988)用核桃无性胚接种带有PCGN200,594质粒的农杆菌，得到了世界上第一个来自无性胚 的转基因植株。 Abhaya M．Dadekar等(1988)用几个核桃品种及其杂种一代的微繁无性系，接种带有PTiAb和 PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。 R. Scorza等(1991)用带有复合质粒的农杆菌6044接种桃的叶片和胚愈伤组织，得到了转基因植株。 F. A. Hanmerschlag等(1989)报道了用桃原生质体和叶等幼嫩组织作基因转移的情况，随后又用微繁的桃嫩茎接种带有 PTiAb 质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。 S. Mante等(1990)用李的下胚轴切片，接种带有PCGH7001或PCGH7314质粒的农杆菌，得到了转基因植株。 新西兰从一种小果实的红肉猕猴桃中分离，提取出控制红肉的基因，然后转移到大果品种中，现已得到了 一个果重708以上的红肉猕猴桃，这是世界上第一个有实用价值的转基因果树。除此之外，新西兰还在苹果上从事 控制成熟期基因的研究。 D. J. James等(1989)在世界上第一个得到了苹果转基因植株，其他学者在苹果砧木，樱桃上还试验了能 产生瘤的标记基因转移，均得到了转基因瘤个体。在梨上也得到了同样结果。 Narender S. Nehra等(1990)和G．Jclenkovic等(1990)分别用草莓叶片和茎节切片、胚轴作材料，接种带 有P81121和PGV3850:1103质粒的农杆菌，均得到了转基因植株。 T. J. Baribault等(1989)用葡萄悬浮细胞与带有PGV3850:1103质粒混合体，或带有双体媒介PGA474-68质粒的农杆 菌，进行共培样，均得到了对卡拉霉索具有抗性的组织，并已证实是稳定结合和表达
宠天智和J.C.Sanford（1989）用番木瓜的叶块、茎、叶柄，接种带有PTiB653：PMOH200质粒的农杆菌，均得到了转基因植株，转移率达80%以上。T.M.Grezie（1990)首次将高速粒子轰击机用于扁桃，对活体植株分生细胞实行基因转移成功。在建立基因图谱方面，美国、日本和英国纷纷投入巨资，从事作物抗旱基因结构，水稻、小麦和玉米基因定位图的研究，我国也从事了水稻基因定位图的研究。在果树方面，美国从事了苹果和葡萄基因定位图的研究，新西兰主要研究苹果和猕猴桃的基因定位图，寻找控制主要性状的基因位点，并通过对亲子代性状的分析，找出亲子代性状的连锁关系，为杂种实生苗的预先选择和最佳杂交组合的选配奠定基础。5.在良种快速繁殖方面目前植物组织培养在生产上应用最有成效的领域就是快速繁殖。一年当中，从理论上计算，较常规繁殖速度可快几十万倍。美国用组织培养方法繁殖苹果矮化砧、草莓、梨及樱桃试管苗，一年可繁殖50万株。这方面世界上很多国家都已用于生产实际，效果明显，这里不再赞述。6.在病毒的消除方面目前柑桔、草莓、菠萝、香蕉、苹果、葡萄、桃、番木瓜等果树的茎尖培养均获得了成功。柑桔、苹果、葡萄、桃和草莓的茎尖培养技术已用于生产。柑桔的无病毒苗木最早还是通过实生播种的珠心苗而得到的。对于单胚品种来说，由于没有珠心胚，实生播种长出的苗都是合子苗，后代因重组和分离造成遗传性不稳定，因而无法通过实生播种获得遗传性稳定的无病毒苗木。1969年美国的RanGan等培养授粉后100天左右的单胚品种柚、坦普尔柑、庞德罗萨柠檬的珠心组织，得到了无病毒苗木。然而，1977年美国的Button等又培养了无核品种华盛顿脐橙的珠心组织，获得了无病毒植株，从而解决了各种类型柑桔的无病毒苗木的培养问题。但是由于种子部分的组织都是童期的，因而由它们分化来的植株进入开花结果期晚，影响了生产上的应用。后来有人改用微茎尖嫁接技术获得了度越童期的柑桔无病毒苗木。其具体做法是：在无菌条件下，从度越了童年期的成年相桔幼嫩技上用显微操作法取出仅带1一3片叶原基的茎尖约1mm)，将此茎尖嫁接于试管中萌发的幼嫩积砧上，嫁接成活率达40%。经鉴定此培养物不带衰退病，裂皮病等病毒病，甚至连热处理不能去除的Dweet（甜橙）斑纹病毒（Mottlevirus）也可通过茎尖嫁接得到排除，而且移到王中后的第二年即能开花，此项技术已与热处理结合被纳入美国柑桔品种改良规划中，作为获得无病毒柑桔苗木的一项重要生产措施。此法同样可用于苹果等果树。另外，香蕉的侧芽经热处理和培养诱导生根，没有检查到CMV及其它病毒。草莓的茎尖培养物产生的小植株经鉴定排除了黄边（yeIIowedge)，黄脉（veinchlorosit），叶脉条带（veinbanding）等病毒病。菠萝经组织培养，排除了一些未经专门命名的病毒病。通过组织培养获得无病毒苗木的技术，现在已扩大到获得无病毒苗木（即无细菌或其它病害），在使用上不仅限于增产目的，而且正在扩大到国际品种交换和种质资源保存方面。当然，利用组织培养技术获得无病毒苗木还必须与植物病毒和病害鉴定技术相结合，因为有个别病毒还不能通过茎尖培养予以消除。7.在种质资源保存方面目前果树资源保存已引起了国内外有关科学工作者的注意，许多国家都有专门搜集保存资源的试验站（种质库）。由于大多数果树资源并不处于直接利用的状态，因而需耗费许多财力和土地才能保存这些植株。目前国外正在研究用组织培养技术作为保存资源的一种手段，如需用地1公项（1万平方米）保存葡萄品种，现用茎尖组织培养，仅需2平方采的面积便可保存15年。美国现在用组织培养法保存柑桔种质资源方面颇有成效。除此之外，还有离体受精以及生长发育与激素的调控等。相信随着生物技术的迅速发展，将会为果树品种的改良开辟更多的新途径，促进现代果树育种学的发展。二茎尖培养的技术要点1一、茎尖培养在果树育种上的应用1）速繁殖良种果树业的迅速发展需要大量优质苗木：良种更新换代频繁，特别是新育成品种，良种母树少，短期内要求提供大量良种苗木，按照传统繁殖方法难以达到这个要求。而利用茎尖离体培养育苗法，可有效地应用于快速繁殖推广良种。2)培育无病毒苗木果树病毒病种类多，危害大，严重影响果树业的发展。按病毒在植物体内分布不均的理论，利用茎尖分生组织离体培养，有可能排除果树长期无性繁殖积累于体内的病毒。通过茎尖脱毒途径，目前已获得柑桔、草菇、香蕉、苹果、番木瓜和罗汉果等无病毒果菌。柑桔和草菇的无病毒菌已应用于生产。3）诱发突变体植物组织与细胆离体培养过程经常诱发各种类型的突变。据统计悬浮细胞培养自发突变率为10一5一10一4（王敬驹，1984)，这些广泛的变异为育种提供丰富的选择基础。利用组织培养技术结合诱变处理，可以大大提高变异率，而且有可能避免或减少嵌合体干扰，提高诱变效果。4)种质的保存与交换由于果树体积大，通常采用种植保存，需要占用大量土地与劳力，耗资大；对资源交换不便，检疫手续复杂。利用茎尖培养法，在试管内保存种质资源，大大节省人力，物力和土地，而且方便种质资源交换，避免病虫传播扩散，防止资源丢失，是值得采用的保存方法。2茎尖培养技术要点1）建立无菌株系无菌营养系的建立是快速繁殖良种的重要环节。首先对接种的外植体要严格选择，挑选种性优良，树体健康，无病虫害，生长健壮发育饱满的芽条，进行灭菌消毒处理。对于含酚类物质较多的外植体，可将切取的材料浸入维生索液中处理，或空培养基中加入抗氧化剂，抑制组织切口氧化变褐。接种材料抽芽后，可初步繁殖一些芽窘备用。2外植体的增殖通常外植体的增殖有三种形式c促使萌发腋芽：形成不定芽：产生胚状体。这三种增殖方式中，萌发腋芽的增殖率可能最低，因为每次增殖的芽苗数量受腋芽数目限制。不定芽的形成具有较大的增殖率，因为继代培养的外植体，其许多部位都可能诱发不定芽。而胚状体的繁殖方式具有最大的增殖潜力，并产生完
庞天智和 J. C. Sanford(1989)用番木瓜的叶块、茎、叶柄，接种带有PTiB653：PMOH200质粒的农杆 菌，均得到了转基因植株，转移率达80％以上。 T．M．Grezie(1990)首次将高速粒子轰击机用于扁桃，对活体植株分生细胞实行基因转移成功。 在建立基因图谱方面，美国、日本和英国纷纷投入巨资，从事作物抗旱基因结构，水稻、小麦和玉米基因 定位图的研究，我国也从事了水稻基因定位图的研究。在果树方面，美国从事了苹果和葡萄基因定位图的研究，新 西兰主要研究苹果和猕猴桃的基因定位图，寻找控制主要性状的基因位点，并通过对亲子代性状的分析，、找出亲 子代性状的连锁关系，为杂种实生苗的预先选择和最佳杂交组合的选配奠定基础。 5．在良种快速繁殖方面 目前植物组织培养在生产上应用最有成效的领域就是快速繁殖。一年当中，从理论上计算，较常规繁殖速度可 快几十万倍。美国用组织培养方法繁殖苹果矮化砧、草莓、梨及樱桃试管苗，一年可繁殖50万株。这方面世界上很 多国家都已用于生产实际，效果明显，这里不再赘述。 6．在病毒的消除方面 目前柑桔、草莓、菠萝、香蕉、苹果、葡萄、桃、番木瓜等果树的茎尖培养均获得了成功。柑桔、苹果、葡萄、桃 和草莓的茎尖培养技术已用于生产。 柑桔的无病毒苗木最早还是通过实生播种的珠心苗而得到的。对于单胚品种来说，由于没有珠心胚，实生 播种长出的苗都是合子苗，后代因重组和分离造成遗传性不稳定，因而无法通过实生播种获得遗传性稳定的无病毒 苗木。1969年美国的 RanGan等培养授粉后100天左右的单胚品种柚、坦普尔柑、庞德罗萨柠檬的珠心组织，得到 了无病毒苗木。然而，1977年美国的 Button 等又培养了无核品种华盛顿脐橙的珠心组织，获得了无病毒植株， 从而解决了各种类型柑桔的无病毒苗木的培养问题。但是由于种子部分的组织都是童期的，因而由它们分化来的植 株进入开花结果期晚，影响了生产上的应用。后来有人改用微茎尖嫁接技术获得了度越童期的柑桔无病毒苗木。其 具体做法是：在无菌条件下，从度越了童年期的成年柑桔幼嫩技上用显微操作法取出仅带 l一3片叶原基的茎尖 (约 l m m)，将此茎尖嫁接于试管中萌发的幼嫩枳砧上，嫁接成活率达40％。经鉴定此培养物不带衰退病，裂皮 病等病毒病，甚至连热处理不能去除的Dweet(甜橙)斑纹病毒( Mottle virus)也可通过茎尖嫁接得到排除，而且移 到土中后的第二年即能开花，此项技术已与热处理结合被纳入美国柑桔品种改良规划中，作为获得无病毒柑桔苗木 的一项重要生产措施。此法同样可用于苹果等果树。另外，香蕉的侧芽经热处理和培养诱导生根，没有检查 到 CMV及其它病毒。草莓的茎尖培养物产生的小植株经鉴定排除了黄边( yeIIow edge)，黄脉（vein chlorosit )，叶脉条带( vein banding)等病毒病。菠萝经组织培养，排除了一些未经专门命名的病毒病。 通过组织培养获得无病毒苗木的技术，现在已扩大到获得无病毒苗木(即无细菌或其它病害)，在使用上不仅 限于增产目的，而且正在扩大到国际品种交换和种质资源保存方面。当然，利用组织培养技术获得无病毒苗木还必 须与植物病毒和病害鉴定技术相结合，因为有个别病毒还不能通过茎尖培养予以消除。 7．在种质资源保存方面 目前果树资源保存已引起了国内外有关科学工作者的注意，许多国家都有专门搜集保存资源的试验站(种质库)。由 于大多数果树资源并不处于直接利用的状态，因而需耗费许多财力和土地才能保存这些植株 。目前国外正在研究 用组织培养技术作为保存资源的一种手段，如需用地 l公顷( l万平方米)保存葡萄品种，现用茎尖组织培养，仅 需2平方米的面积便可保存15年。美国现在用组织培养法保存柑桔种质资源方面颇有成效。 除此之外，还有离体受精以及生长发育与激素的调控等。相信随着生物技术的迅速发展，将会为果树品种 的改良开辟更多的新途径，促进现代果树育种学的发展。 二茎尖培养的技术要点 1一、茎尖培养在果树育种上的应用 1)挟速繁殖良种 果树业的迅速发展需要大量优质苗木；良种更新换代频繁，特别是新育成品种，良种 母树少，短期内要求提供大量良种苗木，按照传统繁殖方法难以达到这个要求。而利用茎尖离体培养育苗法，可有 效地应用于快速繁殖推广良种。 2)培育无病毒苗木 果树病毒病种类多，危害大，严重影响果树业的发展。 按病毒在植物体内 分布不均的理论，利用茎尖分生组织离体培养，有可能排除果树长期无性繁殖积累于体内的病毒。通过茎尖脱毒途 径，目前已获得柑桔、草菇、香蕉、苹果、番木瓜和罗汉果等无病毒果菌。柑桔和草菇的无病毒菌已应用于生产。 3)诱发突变体 植物组织与细胆离体培养过程经常诱发各种类型的突变。据统计悬浮细胞培养自发突变 率为10—5一10—4(王敬驹，1984)，这些广泛的变异为育种提供丰富的选择基础。利用组织培养技术结合诱变处 理，可以大大提高变异率，而且有可能避免或减少嵌合体干扰，提高诱变效果。 4)种质的保存与交换 由于果树体积大，通常采用种植保存，需要占用大量土地与劳力，耗资大；对资 源交换不便，检疫手续复杂。利用茎尖培养法，在试管内保存种质资源，大大节省人力，物力和土地，而且方便种 质资源交换，避免病虫传播扩散，防止资源丢失，是值得采用的保存方法。 2茎尖培养技术要点 1) 建立无菌株系 无菌营养系的建立是快速繁殖良种的重要环节。首先对接种的外植体要严格选择，挑选种 性优良，树体健康，无病虫害，生长健壮发育饱满的芽条，进行灭菌消毒处理。对于含酚类物质较多的外植体，可 将切取的材料浸入维生索液中处理，或空培养基中加入抗氧化剂，抑制组织切口氧化变褐。接种材料抽芽后，可初 步繁殖一些芽窘备用。 2) 外植体的增殖 通常外植体的增殖有三种形式 c促使萌发腋芽；形成不定芽；产生胚状体。这三种增殖 方式中，萌发腋芽的增殖率可能最低，因为每次增殖的芽苗数量受腋芽数目限制。不定芽的形成具有较大的增殖 率，因为继代培养的外植体，其许多部位都可能诱发不定芽。而胚状体的繁殖方式具有最大的增殖潜力，并产生完
整的小植株。作为商业化的良种紧殖，座力求避免产生愈伤组织成苗途径。因为愈伤组织再分化的芽苗，往往产生性状变异，可能出现良种种性不稳定的问题.对于成功的工厂化快速繁殖来说，增殖率是一个重要指标。为了实现在每次继代增殖过程中，产生最大数量的有效紧殖体，必须进行培养基及附加物试验，获得最大紧殖系数的植物生长调节剂配比组合。继代培养间隔的时间，一般以3一4周为宜，不同果树应通过系统试验，确定最高增殖率的转代培养时间。同时还要研究不同材料继代培养次数的最适上限，以便及时采用新建立的无菌株系进行生产。因为随着继代培养次数增加，增殖能力随之下降，变异率会急剧提高。3）芽苗生根与移植外植体大量增殖，通常产生的是无根芽苗。无根芽苗需要诱导生根，采用的生根培养基要降低无机盐浓度，减少糖和琼脂用量，添加吸附剂，如活性炭之类物质，对生根培养有一定作用。无根芽苗经壮苗培养直接进行移菌，可以省略生根培养阶段，对商业化苗木生产，节省工本，缩短试管育苗期有实际意义。试管苗的移植是从“异养”到”自养”的转变过程，移植前试管苗要加强光照，让植株生长健壮，这种炼苗”方法可以提高移植成活率。盆栽的土壤一般用泥炭土、珍珠岩、粗粒状篮石等，将它们按一定比例混合使用。移植后的小菌管理，必须注意控制土壤湿度。掌握光照强度，使小菌逐渐适应外界环境条件。3茎尖培养脱毒方法1)茎尖脱毒的依据过去对果树病毒病的防治收效甚微。最早在1936年KunkeI报μ(Ye1lowvirus)的植34一36℃温度下处理两周，可以使病毒失去生活力。据报道，采用热处理方法对葡萄扇叶病毒，苹果花叶病毒即圆形的病毒或线状的病毒有一定效果。但热处理不能排除所有病毒，同时热处理效果不一，且高温处理极易使材料受损伤，或不能发芽甚至枯死。因此在应用上受到很大限制。More1(1952)发现病毒在植物体内分布不均匀，幼嫩的组织器官含病毒量较低，不带叶原基的生长锥几乎不带病毒.因而可以利用微茎尖进行分离培养脱毒，它与种子脱毒相比，除早结果外，更重要的是能保持母本优良性状。2)茎尖脱毒技术(1)材料预处理通常接种材料先用热处理，使病毒钝化，然后切取较大的茎尖接种，以提高成活蛮。又汰列排除病塞的目的。或格材料稳栽在高温条件下，取生长发育好的新梢？的茎尖接种。（2）切取徽茎尖培养茎尖太大往往容易带病毒，茎尖小带毒量低，但培养成活率低。因此，切取微茎尖时尽量少带时原基。日本下村等（1960）用0.3mm的微茎尖培养，可获得100%的无病毒苗。LuisNavarro等（1975)用柑（1990）1mm微茎尖，或预先热处理的2mm微茎尖培养可获得100%无病毒苗。除柑稿，草莓、罗汉果外，还获得了香蕉（黄瓜花叶病毒，Berg等1974)，（褪绿叶斑病毒，Hsnsenμ(1983），（扇叶病毒，Galzy2972，Iri等，1982，黄斑，斑点和夏季斑驳病毒，Barlass，1982），无（Mul1inaI，1976）等的3)脱毒苗的鉴定通常采用指示植物鉴定，检查脱毒处理得到的苗木是否完全脱毒。或用抗血清鉴定法，这在病毒鉴定中是最有用的方法之一。它是用一种高度专化性的试剂，特异性高，测定的速度快，方法简便。此外，还有电子显徽镜检查法，酶联血清免疫吸附反应(EItSA)，%PCR反应检测技术，可以检测出试管苗所含极少量的病毒，从而使鉴定的灵敏度大大提高。由于脱毒过程高温影响，或微茎尖经愈伤组织分化成苗，后代无性系虽然脱除毒，但可能产生遗传性变异。因此必须进行后代农艺性状鉴定工作。脱毒菌通过鉴定之后，必须建立严格的管理制度进行无病良种的保存、繁殖与推广，防止病毒的再度感染。三胚和胚乳的培养1离体胚培养1)胚培养与育种（1）克服种子休眠，缩短育种周期利用离体胚培养技术，打破种子休眠期，使杂种胚提前萌发成苗，从而缩短果树育种年限。如桃、李等落叶果树，其成熟种子有一段休眠期，通常特种子层积贮存后才能发芽，而采用胚培养技术，可以促进杂i胚提前萌发成苗。(2)克服种子发育不良或中途败育在早熟桃育种中，因果实发育期短，种胚不能完全发育，可以利用胚培养方法，使发育不良的种胚发芽。又如龙眼、荔枝、在酿核品种育种中，可以利用败育前的种胚培养技术，作为酸核品种育种的一种手段。(3）克服多胚品种珠心胚的干扰，培育杂种合子胚，柑搞、杖果、蒲桃等果树具有多胚性，利用胚培养技术，早期分离合予胚培养，可以获得杂种，大大提高杂交育种效率。（4)克服远缘杂交困难，促进远缘杂种发育远缘杂交时，由于不亲和性，不能正常授粉受精，可以采用试管受精，或胚培养技术，使远缘杂交获得成功。(5)诱导胚性愈伤组织，利用幼胚或胚轴，殊心组织等外植体的培养，获得胚性愈伤组织，为原生质体分离、融合或遗传转化提供优质材料。(6)快速繁殖良种砧木离体胚在人工培养条件下，可以产生大量次生胚，加速良种砧本的繁殖；而且胚胎发生技术，也是制作人工种予的重要基础。2离体胚的发育途径（1）．胚脱分化形成愈伤组织离体胚尤其是幼胚，在人工培养下脱分化，形成愈伤组织，特别是生长调节剂浓度高时更为常见。将愈伤组织转人降低生长素等生长调节剂的培养基上，又可能分化出大量胚状体，形成小植株。这种胚性愈伤是建立细胞悬浮培养系，或分离原生质体的良好原始材料。(2)早熟萌发产生畸形芽苗未成熟的幼胚离体培养，往往产生畸形苗，或瘦弱不正常的苗而死亡。这类畸形苗有时可以加以利用，培养变异体作为选种材料
整的小植株。作为商业化的良种繁殖，座力求避免产生愈伤组织成苗途径。因为愈伤组织再分化的芽苗，往往产生 性状变异, 可能出现良种种性不稳定的问题.对于成功的工厂化快速繁殖来说,增殖率是一个重要指标。为了实现 在每次继代增殖过程中，产生最大数量的有效繁殖体，必须进行培养基及附加物试验，获得最大繁殖系数的植物生 长调节剂配比组合。继代培养间隔的时间，一般以3—4周为宜，不同果树应通过系统试验，确定最高增殖率的转代 培养时间。同时还要研究不同材料继代培养次数的最适上限，以便及时采用新建立的无菌株系进行生产。因为随着 继代培养次数增加，增殖能力随之下降，变异率会急剧提高。 3)芽苗生根与移植 外植体大量增殖，通常产生的是无根芽苗。无根芽苗需要诱导生根，采用的生根培养基要降 低无机盐浓度，减少糖和琼脂用量，添加吸附剂，如活性炭之类物质，对生根培养有一定作用。 无根芽苗经壮苗培养直接进行移菌，可以省略生根培养阶段，对商业化苗木生产，节省工本，缩短试 管育苗期有实际意义。 试管苗的移植是从"异养"到"自养"的转变过程，移植前试管苗要加强光照，让植株生长健壮，这 种"炼苗"方法可以提高移植成活率。盆栽的土壤一般用泥炭土、珍珠岩、粗粒状篮石等，将它们按一定比例混合使 用。移植后的小菌管理，必须注意控制土壤湿度。掌握光照强度，使小菌逐渐适应外界环境条件。 3茎尖培养脱毒方法 1)茎尖脱毒的依据 过去对果树病毒病的防治收效甚微。最早在1936年 KunkeI报µ(Ye11ow virus)的 植34—36℃温度下处理两周，可以使病毒失去生活力。据报道，采用热处理方法对葡萄扇叶病毒，苹果花叶病毒， 即圆形的病毒或线状的病毒有一定效果。但热处理不能排除所有病毒，同时热处理效果不一，且高温处理极易使材 料受损伤，或不能发芽甚至枯死。因此在应用上受到很大限制。 Morel(1952)发现病毒在植物体内分布不均匀,幼嫩的组织器官含病毒量较低,不带叶原基的生长锥几乎不带病毒.因 而可以利用微茎尖进行分离培养脱毒,它与种子脱毒相比,除早结果外,更重要的是能保持母本优良性状. 2)茎尖脱毒技术 (1)材料预处理 通常接种材料先用热处理，使病毒钝化，然后切取较大的茎尖接种，以提高成活蛮。 又汰列排除病塞的目的。或格材料稳栽在高温条件下，取生长发育好的新梢？的茎尖接种。 (2)切取徽茎尖培养 茎尖太大往往容易带病毒，茎尖小带毒量低，但培养成活率低。因此，切取微茎尖时尽量 少带时原基。日本下村等(1960)用0．3mm的微茎尖培养，可获得100％的无病毒苗。 Luis Navarro等(1975)用柑 (199O) lmm微茎尖，或预先热处理的2mm微茎尖培养可获得100％无病毒苗。除柑稿，草莓、罗汉果外，还获得了香 蕉(黄瓜花叶病毒， Berg等1974)，(褪绿叶斑病毒， Hsnsenµ(1983)，(扇叶病毒， Galzy2972， Iri等， 1982，黄斑，斑点和夏季斑驳病毒， Barlass，1982)，无(Mullin aI，1976)等的 3)脱毒苗的鉴定 通常采用指示植物鉴定，检查脱毒处理得到的苗木是否完全脱毒。或用抗血清鉴定 法，这在病毒鉴定中是最有用的方法之一。它是用一种高度专化性的试剂，特异性高，测定的速度快，方法简便。 此外，还有电子显徽镜检查法，酶联血清免疫吸附反应(EItSA),¼ PCR反应检测技术，可以检测出试管苗所含极少 量的病毒，从而使鉴定的灵敏度大大提高。 由于脱毒过程高温影响，或微茎尖经愈伤组织分化成苗，后代无性系虽然脱除毒，但可能产生遗传 性变异。因此必须进行后代农艺性状鉴定工作。 脱毒菌通过鉴定之后，必须建立严格的管理制度进行无病良种的保存、繁殖与推广，防止病毒的再 度感染。 三 胚和胚乳的培养 1离体胚培养 1)胚培养与育种 ． (1)克服种子休眠，缩短育种周期 利用离体胚培养技术，打破种子休眠期，使杂种胚提前萌发成苗， 从而缩短果树育种年限。如桃、李等落叶果树，其成熟种子有一段休眠期，通常特种子层积贮存后才能发芽，而采 用胚培养技术，可以促进杂iI胚提前萌发成苗。 (2)克服种子发育不良或中途败育 在早熟桃育种中，因果实发育期短，种胚不能完全发育，可以利用 胚培养方法，使发育不良的种胚发芽。又如龙眼、荔枝、在酿核品种育种中，可以利用败育前的种胚培养技术，作 为酸核品种育种的一种手段。 (3)克服多胚品种珠心胚的干扰，培育杂种合子胚，柑搞、杖果、蒲桃等果树具有多胚性，利用胚培养技 术，早期分离合予胚培养，可以获得杂种，大大提高杂交育种效率。 (4)克服远缘杂交困难，促进远缘杂种发育 远缘杂交时，由于不亲和性，不能正常授粉受精，可以采 用试管受精，或胚培养技术，使远缘杂交获得成功。 (5)诱导胚性愈伤组织 利用幼胚或胚轴，殊心组织等外植体的培养，获得胚性愈伤组织，为原生质体 分离、融合或遗传转化提供优质材料。 (6)快速繁殖良种砧木 离体胚在人工培养条件下，可以产生大量次生胚，加速良种砧本的繁殖；而且 胚胎发生技术，也是制作人工种予的重要基础。 2离体胚的发育途径 (1)．胚脱分化形成愈伤组织 离体胚尤其是幼胚，在人工培养下脱分化，形成愈伤组织，特别是生长 调节剂浓度高时更为常见。将愈伤组织转人降低生长素等生长调节剂的培养基上，又可能分化出大量胚状体，形成 小植株。这种胚性愈伤是建立细胞悬浮培养系，或分离原生质体的良好原始材料。 (2)早熟萌发产生畸形芽苗 未成熟的幼胚离体培养，往往产生畸形苗，或瘦弱不正常的苗而死亡。这 类畸形苗有时可以加以利用，培养变异体作为选种材料
(3）正常胚胎发育途径通常成熟胚在离体培养下，可以正常发育形成小苗。未成熟的幼胚在合适的培养条件下，也可以维持胚性生长，继而进行正常的胚胎发育，完成胚胎发育全过程。从球形胚，心脏形胚，鱼雷形胚，子叶形胚，直至形成小植株。3离体胚培养的方法（1）：种胚培养指成熟胚的培养。由于成熟胚已有胚根和胚芽，一般在含有大量元素的无视盐和蔗糖的培养基上，即可萌发成苗。培养材料的选择，根据胚培养的目的而异，有些早熟品种果实成熟时，胚的发育还不完善，播种不会发芽，通过离体培养方法，可以发育成苗。有些种子中途败育，可在种子败育之前进行培养获得种苗。或有些种子成熟时即休眠，胚培可以缩短休眠期，提早萌发。成熟胚的培养基，一般仅需要提供简单的营养培养基。但对于促进休眠种子萌发，或远缘杂种胚培养，或次生胚的增殖，则需要增加一些有机物，或生长调节剂。一般采用低浓度的生长素，便会促进胚的发育。如赤霉素较广泛应用于促进具有后熟作用的种子萌发，有打破休眠期的作用。胚培的外界条件对胚的生长发育有密切关系。树种不同要求不一，如落叶果树种子有休眠期，因此接种后均需要低温处理，然后转入正常温度培养效果更好。2。原胚培养原胚是指发育阶段处于子叶形成以前的未成熟幼胚，其离体培养技术难度较大，越早期的球形胚，培养越困难，据报道仅柑插已获得成功（图10一1）。原胚培养的主要技术关键：胚的一般成熟胚生长所需条件要求不高。但未成熟的胚，其发育进程不同，要求条件比较复杂，离体培养下则必须提供继续发育相适应的营养条件。根据柑搞胚培研究表明，球形胚的培养与子叶形胚的培养，需要的营养条件和外界环境备不相同，这是原胚培养的技术关键之一。球形胚离体后，为使胚性生长得以继续进行，必须提供与原体相似的环境条件。其中营养培养基的要求，一般除无机盐之外，还需要有微量元素，维生素，氨基酸等。对多数植物来说，改良White，MS培养基都比较适合，另外植物生长情况与pH值都有密切关系。尤其是煎糖浓度，它不仅提供幼胚发育最好的碳源，而且对调整渗透压关系很大。通常在原体内的小球胚，它是生存在较高渗透压的胚乳液里、离体后突然移植于低渗透压的营养培养基中，往往会造成幼胚生长停顿，甚至死亡，必须加以注意。当球形胚离体培养胚器官分化明显时，营养培养基中的蔗糖浓度必须下降，便于胚的继续生长发育。注意对植物生长调节剂使用，促进胚芽或根的生长，并逐步加强光照条件绝2胚乳培养1)胚乳培养与育种胚乳是双受精的产物之一。由于它是一个精核和两个极核融合而成的，，因此，通常是三倍体组织。胚乳培养在果树遗传育种上具有重要意义。通过胚乳培养获得三倍体植株，可能产生无籽果实，在果树生产上有重要的实用价值。胚乳培养再生植株，其染色体有两套来自母体，一套来自父本。因此在杂交育种中，胚乳再生植株的性状与杂种胚发育的植株性状有很大不同，如果树育种和性状遗传规律的研究，提供丰富的材料。近年来，胚乳培养已获得再生植株的果树，有柑桔、批把、枣、苹果、梨、桃和猛猴桃等，为果树无籽果实育种，开辟了一条新的途径。2)培养材料的选择对于未成熟胚乳的培养，选用合适发育期的胚乳进行培养是成功的关键。通常初生胚乳核形成胚乳的方式：有核型胚乳（如苹果、枣、梨、桃、柑描、批把等多数果树），细胞型胚乳（如弥猴桃等）和沼生目型胚乳（菠萝，如核型和细胞型胚乳的中间型）。核型胚乳的发育特点是初生胚乳核，经多次分裂后形成游离核状态，不立刻形成细胞壁。当胚乳核发育到一定阶段，才陆续形成胚乳细胞。对于胚乳的培养，必须在细胞型期进行，而且在细胞型期的某个阶段，分离培养易于成功。不同果树胚乳培养的合适时期，必须进行观测才能确定。为了保证选取合适的材料进行培养，同时义要提高工作效率，必须观测胚乳发育期与幼果外观形态特征的相关性。然后根据外观特征，判断其内部胚乳发育期，便于选择合适的胚乳分离培养。例如，批把幼果外表的黄色绒毛开始脱落，果实表面由黄白色转为绿色时，其内部的胚乳恰好处于旺盛的细胞形状态，可以进行胚乳分离培养。3)胚乳愈伤组织的诱导选取胚乳发育期适宜的幼果或种子，经表面消毒即可切取胚乳培养多数先形成愈伤组织，再诱导分化器官或胚状体，通常使用的基本培养基，有MS，MT，White°Bs等BAO。25mgL与NAAO。5mg/L，KTI。0mg从024—DO.5mgL均可诱导愈伤组织。柑稿胚乳培养用BA0.5—5.0mg从，2，4—D2.Omg儿与CH1000mg从BA0.5mg/L与2，4—D1.Omg/L，或KT0.5m8/L与2，4—D1.Omg儿。批把胚乳培养用BA2.Omg从，2，睡唾—DO。5mg/L，猕猴桃胚乳培养用ZT3.Omg/L，2，4—DO.5一1.Omg/工与CH500mg几2，4一DO.5mg/L，均可诱导愈伤组织。4)器官分化再生植橡胚乳愈伤组织转入分化培养基，从形态发生到再生植株有两条途径。一是产生胚状体发育成苗。另一途径是产生不定芽苗，诱导根形成植株。柑桔和枣等胚乳培养再生植株是通过胚状体途径，将柑桔胚乳愈伤组织，转入MT培养基附加GA2一4mg/L，便诱导出绿色胚状体，并在高浓度的GA（如15mg）下形成植株。苹果和批把等胚乳培养是通过分化不定芽形成植株的途径。此外，在掷猴桃胚乳培养中，采用不同生长索种类可导致不同的分化途径。采用ZT3.Omg/L+NAA0.1mg/L+CH500mg/L的MS培养ZT3.Omg/L与2，4—D1.Omg/L诱导的愈伤组织，转移到ZT1.Omg儿，与CH500mg儿5)胚乳再生植秩的染色体倍性胚乳培养再生植株的染色体，有二倍体、三倍体、多倍体或非整倍体。如苹果胚乳愈伤组织，绝大部分细胞染色体为多倍体和非整倍体，而三倍体细胞仅占2.5%一3.9%。胚乳培养的植株
(3)正常胚胎发育途径 通常成熟胚在离体培养下，可以正常发育形成小苗。未成熟的幼胚在合适的培 养条件下，也可以维持胚性生长，继而进行正常的胚胎发育，完成胚胎发育全过程。从球形胚，心脏形胚，鱼雷形 胚，子叶形胚，直至形成小植株。 3离体胚培养的方法 (1)．种胚培养 指成熟胚的培养。由于成熟胚已有胚根和胚芽，一般在含有大量元素的无视盐和蔗糖 的培养基上，即可萌发成苗。 培养材料的选择，根据胚培养的目的而异，有些早熟品种果实成熟时，胚的发育还不完善，播种不会发 芽，通过离体培养方法，可以发育成苗。有些种子中途败育，可在种子败育之前进行培养获得种苗。或有些种子成 熟时即休眠，胚培可以缩短休眠期，提早萌发。 成熟胚的培养基，一般仅需要提供简单的营养培养基。但对于促进休眠种子萌发，或远缘杂种胚培养，或 次生胚的增殖，则需要增加一些有机物，或生长调节剂。一般采用低浓度的生长素，便会促进胚的发育。如赤霉素 较广泛应用于促进具有后熟作用的种子萌发，有打破休眠期的作用。 胚培的外界条件对胚的生长发育有密切关系。树种不同要求不一，如落叶果树种子有休眠期，因此接 种后均需要低温处理，然后转入正常温度培养效果更好。 2。原胚培养 原胚是指发育阶段处于子叶形成以前的未成熟幼胚，其离体培养技术难度较大，越早期 的球形胚，培养越困难，据报道仅柑插已获得成功(图10—l)。原胚培养的主要技术关键： 胚的 一般成熟胚生长所需条件要求不高。但未成熟的胚，其发育进程不同，要求条件比较复杂， 离体培养下则必须提供继续发育相适应的营养条件。根据柑搞胚培研究表明，球形胚的培养与子叶形胚的培养，需 要的营养条件和外界环境备不相同，这是原胚培养的技术关键之一。 球形胚离体后，为使胚性生长得以继续进行，必须提供与原体相似的环境条件。其中营养培养基的要 求，一般除无机盐之外，还需要有微量元素，维生素，氨基酸等。对多数植物来说，改良 White, MS培养基都比 较适合,另外植物生长情况与 pH值都有密切关系。尤其是蔗糖浓度，它不仅提供幼胚发育最好的碳源，而且对调 整渗透压关系很大。通常在原体内的小球胚，它是生存在较高渗透压的胚乳液里、离体后突然移植于低渗透压的营 养培养基中，往往会造成幼胚生长停顿，甚至死亡，必须加以注意。 当球形胚离体培养胚器官分化明显时，营养培养基中的蔗糖浓度必须下降，便于胚的继续生长发 育。注意对植物生长调节剂使用，促进胚芽或根的生长，并逐步加强光照条件绝 2胚乳培养 1)胚乳培养与育种 胚乳是双受精的产物之一。由于它是一个精核和两个极核融合而成的，’因此，通常是 三倍体组织。 胚乳培养在果树遗传育种上具有重要意义。通过胚乳培养获得三倍体植株，可能产生无籽果实， 在果树生产上有重要的实用价值。胚乳培养再生植株，其染色体有两套来自母体，一套来自父本。因此在杂交育种 中，胚乳再生植株的性状与杂种胚发育的植株性状有很大不同，如果树育种和性状遗传规律的研究，提供丰富的材 料。 近年来，胚乳培养已获得再生植株的果树，有柑桔、批把、枣、苹果、梨、桃和猛猴桃等，为果树 无籽果实育种，开辟了一条新的途径。 2)培养材料的选择 对于未成熟胚乳的培养，选用合适发育期的胚乳进行培养是成功的关键。通常初生 胚乳核形成胚乳的方式：有核型胚乳(如苹果、枣、梨、桃、柑描、批把等多数果树)，细胞型胚乳(如弥猴桃等)和 沼生目型胚乳(菠萝，如核型和细胞型胚乳的中间型)。核型胚乳的发育特点是初生胚乳核，经多次分裂后形成游离 核状态，不立刻形成细胞壁。当胚乳核发育到一定阶段，才陆续形成胚乳细胞。对于胚乳的培养，必须在细胞型期 进行，而且在细胞型期的某个阶段，分离培养易于成功。不同果树胚乳培养的合适时期，必须进行观测才能确定。 为了保证选取合适的材料进行培养，同时又要提高工作效率，必须观测胚乳发育期与幼果外观形态特 征的相关性。然后根据外观特征，判断其内部胚乳发育期，便于选择合适的胚乳分离培养。例如，批把幼果外表的 黄色绒毛开始脱落，果实表面由黄白色转为绿色时，其内部的胚乳恰好处于旺盛的细胞形状态，可以进行胚乳分离 培养。 3)胚乳愈伤组织的诱导 选取胚乳发育期适宜的幼果或种子，经表面消毒即可切取胚乳培养多数先形成愈伤组 织，再诱导分化器官或胚状体，通常使用的基本培养基，有MS， MT， Whiteº Bs等 BA0。25mgL与 NAA0。5mg ／L， KTI。0mg从Ó24—D0．5mgL均可诱导愈伤组织。柑稿胚乳培养用 BA0．5—5．0mg从，2，4—D2．0mg儿 与 CH1000mg从 BA0．5mg／L与2，4—D1．0mg／L，或 KT0．5m8／L与2，4—D1．0mg儿。批把胚乳培养 用 BA2．0mg从，2，唾—D0。5mg／L，猕猴桃胚乳培养用 ZT3．0mg／L，2，4—D0．5一1．0mg／工与 CH500mg 几2，4—D0．5mg／L，均可诱导愈伤组织。 4)器官分化再生植橡 胚乳愈伤组织转入分化培养基，从形态发生到再生植株有两条途径。一是产生胚状 体发育成苗。另一途径是产生不定芽苗，诱导根形成植株。柑桔和枣等胚乳培养再生植株是通过胚状体途径，将柑 桔胚乳愈伤组织，转入 MT培养基附加GA2—4mg／L，便诱导出绿色胚状体，并在高浓度的 GA(如15mg )下形成植株。苹果和批把等胚乳培养是通过分化不定芽形成植株的途径。 此外，在掷猴桃胚乳培养中，采用不同生长索种类可导致不同的分化途径。采用ZT3．0mg／L+NAA0.1mg／L+ CH500mg／L的 MS培养ZT3．0mg／L与2，4—Dl.0mg／L诱导的愈伤组织，转移到 ZT1．0mg儿，与 CH500mg儿 5)胚乳再生植秩的染色体倍性 胚乳培养再生植株的染色体，有二倍体、三倍体、多倍体或非整倍体。如苹果 胚乳愈伤组织，绝大部分细胞染色体为多倍体和非整倍体，而三倍体细胞仅占2．5％一3．9％。胚乳培养的植株