兔疲分 折技术 加积 和相美 仪器 扩克 首页→第十六章免疫分析技术和相关仪器 免疫分析和测定的对象是抗原或抗体，不论是经典的凝集反应还是现代免 疫标记技术，其基础都是抗原抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质 专一、高效价和高灵敏的抗体是任何免疫分析技术的物质基础。从1888年德国 学者Behring和日本学者北里用白喉外毒素免疫家兔，在免疫的血清发现凝集素 (agglutinin)和之后其发现抗毒素和凝集素为同一物质并统一称之为抗体 (antibody,Ab)起，抗体作为诊断和治疗疾病的应用已有上百年历史。抗体研究 领域的进展大致可分为3个阶段：(1)以1890年Behring发现白喉抗毒素- 第一代多克降抗体为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体：(2) 以1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表：(3)以1994年Winter 以基因工程方法制备抗体为代表，这是抗体研究领域出现的又一次技术苹命。随 着抗体技术制备的日趋进步和抗体载体/（标记物）的不断发现，可以预见，免 疫学检测的内容将会越来越多，检测方法和设备也将不断推出，更新，由此对基 础和临床免疫研究将起到极大的促进作用。本部分内容重点介绍目前国内外关于 抗体制备研究概况，免疫检测技术和新型抗体的研究进展。 一、基于制备枝木的杭体美型： 1.多克隆抗体在早期，传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途 径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以其可刺激产生多种抗体 形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分子，故在血清中实际上是含有 多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是
免疫分 析技术 和相关 仪器 知识 扩充 首页 → 第十六章 免疫分析技术和相关仪器 免疫分析和测定的对象是抗原或抗体，不论是经典的凝集反应还是现代免 疫标记技术，其基础都是抗原抗体反应。很显然，在免疫分析技术中，获得优质、 专一、高效价和高灵敏的抗体是任何免疫分析技术的物质基础。从 1888 年德国 学者 Behring 和日本学者北里用白喉外毒素免疫家兔，在免疫的血清发现凝集素 (agglutinin)和之后其发现抗毒素和凝集素为同一物质并统一称之为抗体 (antibody,Ab)起，抗体作为诊断和治疗疾病的应用已有上百年历史。抗体研究 领域的进展大致可分为 3 个阶段： （1）以 1890 年 Behring 发现白喉抗毒素- 第一代多克隆抗体为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；（2） 以 1975 年 Kohler 创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；（3）以 1994 年 Winter 以基因工程方法制备抗体为代表，这是抗体研究领域出现的又一次技术革命。随 着抗体技术制备的日趋进步和抗体载体/（标记物）的不断发现，可以预见，免 疫学检测的内容将会越来越多，检测方法和设备也将不断推出，更新，由此对基 础和临床免疫研究将起到极大的促进作用。本部分内容重点介绍目前国内外关于 抗体制备研究概况，免疫检测技术和新型抗体的研究进展。 一、基于制备技术的抗体类型： 1.多克隆抗体 在早期，传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途 径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以其可刺激产生多种抗体 形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分子，故在血清中实际上是含有 多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是
第一代抗体。此技术经过长期的实践，己发展相当的成热，在免疫学诊断中，例 如，其对血型和组织抗原的鉴定有着非常重要意义，其现在仍然在基础研究和体 外诊断方面进行广泛应用。多克隆抗体也可研究与开发成抗体药物，例如 Thymoglobulin是美国Sangstat公司的产品，1999年，美国FDA批准了 Thymoglobulin用于治疗肾移植手术的急性排异反应，2002年，加拿大也批准了 Thymoglobulin。2000年9月，FDA还批准了Thymoglobulin作为 Myelody-splastic Syndrome(WDS)的罕见病用药，其是用人的胸腺细胞免疫家兔 后纯化其中的免疫球蛋白得到的多抗药物。 2.单克隆抗体1975年，德国的学者Kohler和英国的学者Milstein将 小鼠骨髓瘤细胞和经过绵羊红细胞(sheepredbloodcell,SRBC)免疫的小鼠脾细 胞在体外进行两种细胞的融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培 养条件下生长繁殖，又能分泌抗SBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤 (hybridoma)。其是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体， 故称之为单克隆抗体。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体，只要 这种抗原能引起小鼠的抗体应答。这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第 二代抗体。 单克隆抗体由于其纯度高、特异性强，可提高各种血清学的方法检测抗原的 敏感性和特异性。单克隆抗体的应用，其大大促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊 断的准确性。单克隆抗体亦可用于对各种免疫细胞等组织细胞表面分子的检测， 这对免疫细胞的分离、鉴定和分类，以及研究各种膜表面分子的结构和功能，具 有重要意义。但是这种单克隆抗体，其多是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经过细胞 融合形成的杂交瘤细胞分泌的，属鼠源性蛋白，进入人体会引起机体的排异反应： 其完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；其生产成本较高。 英国剑桥大学的DrKarpas最近取得突破性的进展，成功地建立了人骨髓瘤 细胞系Karpas7?O7H,其与人B细胞融合后，能稳定高产地分泌全人抗体。此人 人杂交瘤技术克服了以前技术的不足之处，使人类有可能筛选出由人类免疫系统 所产生的最有效的治疗性抗体，建立人类抗体库，即进行免疫组学或抗体组学的 研究。在疾病的治疗中，此人一人杂交瘤技术将发挥巨大的作用，其拥有极其 阔的应用前景
第一代抗体。此技术经过长期的实践，已发展相当的成熟，在免疫学诊断中，例 如，其对血型和组织抗原的鉴定有着非常重要意义，其现在仍然在基础研究和体 外诊断方面进行广泛应用。多克隆抗体也可研究与开发成抗体药物，例如， Thymoglobulin 是美国 Sangstat 公司的产品，1999 年，美国 FDA 批准了 Thymoglobulin 用于治疗肾移植手术的急性排异反应，2002 年，加拿大也批准了 Thymoglobulin。2000 年 9 月，FDA 还批准了 Thymoglobulin 作为 Myelody-splastic Syndrome(MDS)的罕见病用药，其是用人的胸腺细胞免疫家兔 后纯化其中的免疫球蛋白得到的多抗药物。 2.单克隆抗体 1975 年，德国的学者 Kohler 和英国的学者 Milstein 将 小鼠骨髓瘤细胞和经过绵羊红细胞(sheepredbloodcell，SRBC)免疫的小鼠脾细 胞在体外进行两种细胞的融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培 养条件下生长繁殖，又能分泌抗 SRBC 抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤 （hybridoma）。其是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体， 故称之为单克隆抗体。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体，只要 这种抗原能引起小鼠的抗体应答。这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第 二代抗体。 单克隆抗体由于其纯度高、特异性强，可提高各种血清学的方法检测抗原的 敏感性和特异性。单克隆抗体的应用，其大大促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊 断的准确性。单克隆抗体亦可用于对各种免疫细胞等组织细胞表面分子的检测， 这对免疫细胞的分离、鉴定和分类，以及研究各种膜表面分子的结构和功能，具 有重要意义。但是这种单克隆抗体，其多是由鼠 B 细胞与鼠骨髓瘤细胞经过细胞 融合形成的杂交瘤细胞分泌的，属鼠源性蛋白，进入人体会引起机体的排异反应； 其完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；其生产成本较高。 英国剑桥大学的 DrKarpas 最近取得突破性的进展，成功地建立了人骨髓瘤 细胞系 Karpas707H，其与人 B 细胞融合后，能稳定高产地分泌全人抗体。此人- 人杂交瘤技术克服了以前技术的不足之处，使人类有可能筛选出由人类免疫系统 所产生的最有效的治疗性抗体，建立人类抗体库，即进行免疫组学或抗体组学的 研究。在疾病的治疗中，此人-人杂交瘤技术将发挥巨大的作用，其拥有极其广 阔的应用前景
3.基因工程抗体在现代生物技术研究的早期，鼠单抗有着广泛应用。但 是由于鼠单抗的免疫原性和另外的副作用，只有极少数最后发展成有效的治疗性 产品。10多年前，随着革命性的基因工程抗体技术应用于鼠免疫球蛋白的人源 化改造，在降低甚至消除人抗鼠抗体反应之后，单抗发展显示出了良好的前景。 在20世纪80年代的初期，抗体基因的结构和功能的研究成果与重组DNA技 术互相结合，产生了基因工程抗体技术。基因工程抗体，即按不同的需要，将抗 体的基因进行加工、改造和重新装配，然后再导入到适当的受体细胞内进行表达 的抗体分子，这也就是第三代抗体。与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有的优 点有：通过基因工程技术的改造，可降低甚至消除人体对抗体的排斥反应：基因 工程抗体的分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，进 入病灶的核心部位：根据疾病的类型和部位，制备新型抗体：可采用原核细胞、 真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。 噬菌体抗体库继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的 是噬菌体抗体库技术。Winter等人在I994年创建了噬菌体抗体库技术，克服了 人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工 程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体 基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛(panning) 在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基 因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体 工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于 制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的 研究推向了新高潮。 二、免度散我枝术 免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包 被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质（抗原或抗体），使其致敏为免疫微 粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以 某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合 方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒 如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒（用
3.基因工程抗体 在现代生物技术研究的早期，鼠单抗有着广泛应用。但 是由于鼠单抗的免疫原性和另外的副作用，只有极少数最后发展成有效的治疗性 产品。10 多年前，随着革命性的基因工程抗体技术应用于鼠免疫球蛋白的人源 化改造，在降低甚至消除人抗鼠抗体反应之后，单抗发展显示出了良好的前景。 在 20 世纪 80 年代的初期，抗体基因的结构和功能的研究成果与重组 DNA 技 术互相结合，产生了基因工程抗体技术。基因工程抗体，即按不同的需要，将抗 体的基因进行加工、改造和重新装配，然后再导入到适当的受体细胞内进行表达 的抗体分子，这也就是第三代抗体。与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有的优 点有：通过基因工程技术的改造，可降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；基因 工程抗体的分子量较小，可部分降低抗体的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，进 入病灶的核心部位；根据疾病的类型和部位，制备新型抗体；可采用原核细胞、 真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。 噬菌体抗体库 继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的 是噬菌体抗体库技术。Winter 等人在 1994 年创建了噬菌体抗体库技术，克服了 人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工 程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体 基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛（panning）， 在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基 因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体 工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于 制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的 研究推向了新高潮。 二、免疫微粒技术 免疫微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作为载体，包 被上具有特异性亲和力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫微 粒，用于免疫学及其他生物学检测与分离的一项技术。作为载体的微粒通常是以 某种高分子有机单体为原料，经过乳液聚合、悬浮聚合及辐照聚合等高分子聚合 方法制备而成。由于制备材料及工艺不同，微粒的种类繁多，现已制成惰性微粒 如聚苯乙烯胶乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及标记微粒(用
同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与 抗原（或抗体）经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等致敏方法形成免疫 微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别 等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA与RNA的分离及PCR等研究领域亦 显示出广阔的应用前景。 1.胶乳微粒免疫检测技术 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定 性试验基础上发展建立的-种非放射性均相 免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和 小分子半抗原（加药物、团体激素等）进行精 确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳 微粒（一般为直径约1μm的聚苯乙烯胶乳）， 与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反 应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关 系，由此可测出标本中待测物的含量。测定 方法主要有粒子计数法和浊度法两种。 2.兔疫磁性微粒分离与纯化技术 性微粒结合并分高0-157 磁性微粒(magnetic microspheres, MWS)是80年代初，用高分子材料和金属 离子为原料，聚合而成的一种以金属离子 磁性微粒分离细胞
同位素、荧光素或酶标记)等四大类微粒，数量多达几十种。将制备好的微粒与 抗原(或抗体)经物理吸附、化学偶联及生物素亲合亲桥联法等致敏方法形成免疫 微粒。广泛应用于各种可溶性大分子物质的检测、分离与纯化、细胞标记与识别 等。近年来，微粒技术在核酸分子杂交、DNA 与 RNA 的分离及 PCR 等研究领域亦 显示出广阔的应用前景。 1. 胶乳微粒免疫检测技术 胶乳微粒免疫检测技术是在胶乳凝集定 性试验基础上发展建立的-种非放射性均相 免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和 小分子半抗原(加药物、团体激素等)进行精 确的定量测定。根据特异性抗体致敏的胶乳 微粒(一般为直径约 1μm 的聚苯乙烯胶乳)， 与待测标本中的相应抗原相遇时发生凝集反 应，胶乳凝集程度与被测物的浓度呈函数关 系，由此可测出标本中待测物的含量。测定 方法主要有粒子计数法和浊度法两种。 2. 免疫磁性微粒分离与纯化技术 磁性微粒(magnetic microspheres, MMS) 是 80 年代初，用高分子材料和金属 离子为原料，聚合而成的一种以金属离子 胶乳微粒 磁性微粒分离细胞 磁性微粒结合并分离 O-157
为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸 引作用，MS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将MS应用于 免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成免疫WS,与检样 中的抗原结合形成免疫MS-靶分子（或靶细胞）复合体，通过外加磁场的作用即 可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的 免疫MS,即可获得纯化的靶分子或细胞。 三、扰体库枝术 90年代初提出了抗体库技术。抗体库技术简单地说就是用细菌克隆取代B 细胞克隆来表达抗体库(repertoire)。由于T-PCR技术的发展，大肠杆菌直 接表达有功能性抗体分子片断的成功以及噬菌体显示技术(phage display)的 问世，在90年代初出现噬菌体抗体库(phage antibody library)技术，该技 术使得人们从应用DNA重组技术改造现有的单抗发展到用基因工程技术克隆新 的单抗，从而使抗体工程进入一个全新的时期。 噬菌体抗体库继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的 是噬菌体抗体库技术。Winter等人在1994年创建了噬菌体抗体库技术，克服了 人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因了 程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体 基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛(panning) 在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基 因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体 工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于 制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的 研究推向了新高潮
为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸 引作用，MMS 可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将 MMS 应用于 免疫检测，可使操作过程大为简化。经过特异性抗体包被制成免疫 MMS，与检样 中的抗原结合形成免疫 MMS-靶分子(或靶细胞)复合体，通过外加磁场的作用即 可与其他成分分离开来。再以适当方式使复合体解离，在磁场吸引下除去游离的 免疫 MMS，即可获得纯化的靶分子或细胞。 三、抗体库技术 90 年代初提出了抗体库技术。抗体库技术简单地说就是用细菌克隆取代 B 细胞克隆来表达抗体库（repertoire）。由于 RT-PCR 技术的发展，大肠杆菌直 接表达有功能性抗体分子片断的成功以及噬菌体显示技术（phage display）的 问世，在 90 年代初出现噬菌体抗体库（phage antibody library）技术，该技 术使得人们从应用 DNA 重组技术改造现有的单抗发展到用基因工程技术克隆新 的单抗，从而使抗体工程进入一个全新的时期。 噬菌体抗体库 继杂交瘤技术之后又一突破性进展的用于制备新型抗体的 是噬菌体抗体库技术。Winter 等人在 1994 年创建了噬菌体抗体库技术，克服了 人体不能随意免疫的缺点，用人的外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工 程抗体。而且将抗体基因的克隆和表达融为一体，同在一种载体上进行，将抗体 基因表达在载体的表面，用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛（panning）， 在数日内就可筛选出阳性克隆，从而能构建出大库容文库囊括天然全套抗体基 因，人们完全可以用基因工程方法研制任何一种具有高度特异性的抗体，使抗体 工程的设想成为现实。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于 制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性抗体、高亲和力抗体。同时也将抗体工程的 研究推向了新高潮