1、载体DNA的分离 DNA分离纯化→限制酶切÷脱磷酸化反应 2、大片段的制备 ①酶切法: ②物理切割法: 总DNA分离纯化÷物理切割法超声浪(300bp)或 机械搅拌(8kb)或酶切法(内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片断。)→分离特定大小 DNA片段 不完全酶解:产生随机性的DNA片段,片段大小取决于内 切酶识别的位点数和酶解程度。 识别4对碱基的内切酶适用于制备120kb的DNA片段
① 酶切法： ② 物理切割法： 1、载体DNA的分离 DNA分离纯化→限制酶切 → 脱磷酸化反应 2、大片段的制备 总DNA分离纯化→物理切割法[超声波（300bp）或 机械搅拌（8kb）]或酶切法（内切酶Sau3A进行局部消 化。可得到10-30kb的随机片断。 ）→分离特定大小 DNA片段 不完全酶解：产生随机性的DNA片段，片段大小取决于内 切酶识别的位点数和酶解程度。 识别4对碱基的内切酶适用于制备1~20kb的DNA片段
DNA的不完全酶切 目的片段低熔点琼脂糖回收 A BC DE GH I 10987654321 7 目! 21.2kb 16.8kb 了4kb Rhizobium arachis tota dna digested with Ba■HI Lane 1 dna arker: Lane 2-10, dna digested with 6u, 3u. 1. 5u 0.05 u enzY■e
DNA的不完全酶切 目的片段低熔点琼脂糖回收
3、载体与基因组DNA大片段的连接 内切酶,将λ载体切成三段:左臂、右臂、中间片段 00 O m山 左臂可置换区□右臂 20kb 14kb gkb
内切酶，将载体切成三段：左臂、右臂、中间片段 左臂 可置换区 右臂 Sal I BamH I EcoR I EcoR I BamH I Sal I 20kb 14kb 9kb 3、载体与基因组DNA大片段的连接
20kb fragment λ vector arms with sticky ends with sticky ends Mix human dna fragments and i arms Seal with DNA ligase 左臂右臂 左臂插入片段‖右臂 插入片段插入片段
左臂 插入片段 左臂 右臂 插入片段 插入片段 右臂