实验五 细菌的荚膜染色 一、目的要求 1、学习并掌握负染色法的染色技术。 2、学会观察细菌的荚膜。 二、实验原理 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设 法使菌体和背景着色荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的 含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。 推荐的下列三种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜 的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。 三、实验器材 1、菌种胶质芽胞杆菌(Bacillus Mucilaginosus,俗称“钾细菌”)。 2、试剂用滤纸过滤后的绘图墨水、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、 甲醇，Tyler法染色液：结晶紫0.1g、冰醋酸0.25ml、蒸馏水100mL、20%CuS0 水溶液。 3、器皿载玻片、玻片搁架等。 4、仪器显微镜。 5、其他擦镜纸、香柏油、二甲苯 四、操作步藤 1、湿墨水法 (I)制菌液先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量菌体与其充分混合 均匀。 (2)加盖玻片放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸， 向下轻压，吸收多余的菌液。 (3)镜检用低倍镜或高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 2、干墨水法 (1)制菌液加1滴6%葡萄糖液于洁净玻片一端，挑少量钾细菌与其充分 混合，再加1环墨水，充分混匀。 (2)制片左手执玻片，右手另拿一光滑的载玻片（作推片用），将推片 端的边缘置于菌液前方，然后稍向后拉。当与菌液接触后，轻轻地向左右移动
实验五 细菌的荚膜染色 一、目的要求 1、学习并掌握负染色法的染色技术。 2、学会观察细菌的荚膜。 二、实验原理 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设 法使菌体和背景着色荚膜不着色，因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的 含水量在 90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。 推荐的下列三种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜 的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。 三、实验器材 1、菌种 胶质芽胞杆菌（Bacillus Mucilaginosus，俗称“钾细菌” ）。 2、试剂 用滤纸过滤后的绘图墨水、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、 甲醇，Tyler 法染色液：结晶紫 0.1g、冰醋酸 0.25mI、蒸馏水 100mL、20%CuSO4 水溶液。 3、器皿 载玻片、玻片搁架等。 4、仪器 显微镜。 5、其他 擦镜纸、香柏油、二甲苯。 四、操作步骤 1、湿墨水法 （l）制菌液 先加 l 滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量菌体与其充分混合 均匀。 （2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸， 向下轻压，吸收多余的菌液。 （3）镜检 用低倍镜或高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。 2、干墨水法 （l）制菌液 加 l 滴 6%葡萄糖液于洁净玻片一端，挑少量钾细菌与其充分 混合，再加 l 环墨水，充分混匀。 （2）制片 左手执玻片，右手另拿一光滑的载玻片（作推片用），将推片一 端的边缘置于菌液前方，然后稍向后拉。当与菌液接触后，轻轻地向左右移动
使菌液沿推片接触边缘散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液推向玻片另 一端，使菌液铺成一薄膜。 (3)干燥空气中自然干燥 (4)固定用甲醇浸没涂片，固定1mim,立即倾去甲醇。 (5)干燥在酒精灯上方，用文火干燥。 (6)染色用甲基紫染1~2min。 (7)水洗用自来水轻洗，自然干燥。 (8)镜检用低倍镜或高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。 3、Tyler法 (1)涂片按常规法涂片，可多挑些菌苔与水充分混合，并将粘稠的菌液 尽量擦开，但涂布的面积不宜过大。 (2)干燥在空气中自然干燥。 (3)染色用yler染色液染5-7min. (4)脱色用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（约冲洗2遍）。 用吸水纸吸干，并立即加人2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。 (5)镜检用低倍镜或高倍镜观察。 结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色 五、注意事项 1、加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。 2、应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发 热。 3、在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4 冲洗
使菌液沿推片接触边缘散开，然后以 30 度角，迅速而均匀地将菌液推向玻片另 一端，使菌液铺成一薄膜。 （3）干燥 空气中自然干燥。 （4）固定 用甲醇浸没涂片，固定 1min，立即倾去甲醇。 （5）干燥 在酒精灯上方，用文火干燥。 （6）染色 用甲基紫染 1~2min。 （7）水洗 用自来水轻洗，自然干燥。 （8）镜检 用低倍镜或高倍镜观察。 结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。 3、Tyler 法 （l）涂片 按常规法涂片，可多挑些菌苔与水充分混合，并将粘稠的菌液 尽量擦开，但涂布的面积不宜过大。 （2）干燥 在空气中自然干燥。 （3）染色 用 Tyler 染色液染 5~7min。 （4）脱色 用 20%CuSO4 水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（约冲洗 2 遍）。 用吸水纸吸干，并立即加 l~2 滴香柏油于涂片处，以防止 CuSO4 结晶的形成。 （5）镜检 用低倍镜或高倍镜观察。 结果： 背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。 五、注意事项 1、加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。 2、应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发 热。 3、在采用 Tyler 法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用 20%CuSO4 冲洗
实验六 细菌的鞭毛染色 一、目的要求 1、学习并掌握鞭毛的染色技术。 2、学会观察细菌的鞭毛。 二、实验原理 细菌的鞭毛极细，直径一般为10-20m,只有用电子显微镜才能观察到。但 是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很 多、但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭 毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配 制而成。现推荐以下两种染色法。 三、实验器材 1、菌种普通变形杆菌(Proteus vulgaris)或粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens） 2、仪器显微镜（有油镜）。 3、其他载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸，吸水纸、记号笔、玻片搁架、 镊子、接种环等。 4、试剂硝酸银染色液(A、B液)、Leifson染色液。 四、操作步骤 1、银染色法 (1)清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相 互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉煮 沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒)，煮沸20mi。取出稍冷后用自来水冲洗、晾 干，再放入浓洗液中浸泡5~6天。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸 馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。过火去乙醇，立即使用。 (2)配制染料见附录。 (3)菌液的制备及涂片菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应 将普通变形杆菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面 基部含有冷凝水)，连续移接几代，以增强细菌的活动力。最后一代菌种放37℃ 恒温箱中培养15~18h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环， 移至盛有1-2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放27℃恒温箱 中静置10min(放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落)，让幼龄菌的鞭毛松展开
实验六 细菌的鞭毛染色 一、目的要求 1、学习并掌握鞭毛的染色技术。 2、学会观察细菌的鞭毛。 二、实验原理 细菌的鞭毛极细，直径一般为 10~20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但 是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很 多、但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭 毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配 制而成。现推荐以下两种染色法。 三、实验器材 1、菌种 普通变形杆菌（Proteus vulgaris ）或粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens） 2、仪器 显微镜（有油镜）。 3、其他 载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸，吸水纸、记号笔、玻片搁架、 镊子、接种环等。 4、试剂 硝酸银染色液（A、B 液）、Leifson 染色液。 四、操作步骤 1、银染色法 （1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相 互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉滤过液中（洗衣粉煮 沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸 20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾 干，再放入浓洗液中浸泡 5~6 天。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸 馏水洗。将水沥干后，放入 95%乙醇中脱水。过火去乙醇，立即使用。 （2）配制染料 见附录。 （3）菌液的制备及涂片 菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应 将普通变形杆菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面 基部含有冷凝水），连续移接几代，以增强细菌的活动力。最后一代菌种放 37℃ 恒温箱中培养 15~18h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环， 移至盛有 1~2mL 无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放 27℃恒温箱 中静置 10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开
然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向 另一端，用吸水纸吸去多余的菌液，涂片放空气中干燥。 (4)染色 ①滴加A液，染46min ②用蒸馏水充分洗净A液。 ③用B液冲去残水，再加B液于玻片上，用微火加热至冒气约维持0.5Imim (加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干调区)。 ④用蒸馏水洗，自然干燥 ⑤镜检用油镜检查。 结果细胞和鞭毛均呈深褐色至黑色。 2、Leifson染色法（改良法） (1)清洗玻片法同1。 (2)配制染料见附录 (3)菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同1。 ②用削尖的蜡笔在洁净的玻片上划分3~4个相等的区域。 ③放1滴菌液于每个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤 纸吸去多余的菌液。 ④干燥在空气中自然干燥。 (4)染色 ①加染色液第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，以 后以此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节 约材料 在染色过程中要仔细观察。当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色 膜时，即用水轻轻地冲洗。一般约染10min。 ②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增 加背景的沉淀。 ③干燥：自然干燥。 (5)镜检用油镜观察。 结果：细胞和鞭毛均染成红色。 五、注意事项 1、银染色法比较容易掌握，但染色液必须每次配制，比较麻烦。 2、Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，要掌握好染色条件必 须经过一些摸索
然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向 另一端，用吸水纸吸去多余的菌液，涂片放空气中干燥。 （4）染色 ①滴加 A 液，染 4~6min。 ②用蒸馏水充分洗净 A 液。 ③用 B 液冲去残水，再加 B 液于玻片上，用微火加热至冒气约维持 0.5~1min （加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。 ④用蒸馏水洗，自然干燥。 ⑤镜检 用油镜检查。 结果 细胞和鞭毛均呈深褐色至黑色。 2、Leifson 染色法（改良法） （1）清洗玻片法同 1。 （2）配制染料 见附录。 （3）菌液的制备及涂片 ①菌液的制备同 l。 ②用削尖的蜡笔在洁净的玻片上划分 3~4 个相等的区域。 ③放 l 滴菌液于每个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤 纸吸去多余的菌液。 ④干燥 在空气中自然干燥。 （4）染色 ①加染色液第—区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，以 后以此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节 约材料。 在染色过程中要仔细观察。当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色 膜时，即用水轻轻地冲洗。一般约染 10min。 ②水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增 加背景的沉淀。 ③干燥：自然干燥。 （5）镜检 用油镜观察。 结果： 细胞和鞭毛均染成红色。 五、注意事项 1、银染色法比较容易掌握，但染色液必须每次配制，比较麻烦。 2、Leifson 染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，要掌握好染色条件必 须经过一些摸索
3、细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭 毛脱落。 4、染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 实验七细菌的运动性观察 一、目的要求 学习悬滴法标本片的制作方法，并观察细菌的运动。 二、实验原理 细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观 察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是 否有鞭毛，对采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细 菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛，此法较快速、简便。此外， 这两种方法也可用来检查微生物对各种化学物质的反应。 悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其四周涂上凡士林，然后将 它覆盖在凹玻片上，使菌液对准凹槽中央，即可放置在普通光学显微镜下观察 水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌都有鞭毛。 有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时应 选用幼龄茵。 三、实验器材 1、菌种普通变形杆菌(Proteus vulgari心)（菌龄15~18h)、金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aerginosa）(菌龄 1418h) 2、器皿凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管。 3、其他擦镜纸，香柏油、二甲苯、凡士林等。 四、操作步骤 采用悬滴法，具体步骤如下： 1、制备菌液在幼龄菌斜面上，滴加1-~2mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬
3、细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭 毛脱落。 4、染色用玻片 干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。 实验七 细菌的运动性观察 一、目的要求 学习悬滴法标本片的制作方法，并观察细菌的运动。 二、实验原理 细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观 察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是 否有鞭毛，对采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检查活细 菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛，此法较快速、简便。此外， 这两种方法也可用来检查微生物对各种化学物质的反应。 悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其四周涂上凡士林，然后将 它覆盖在凹玻片上，使菌液对准凹槽中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。 水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。 大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌都有鞭毛。 有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时应 选用幼龄菌。 三、实验器材 1、菌种 普通变形杆菌（Proteus vulgaris）（菌龄 15~18h）、金黄色葡萄球 菌（Staphylococcus aureus）、铜绿色假单胞菌（Pseudomonas aerginosa ）（菌龄 14~18h） 2、器皿 凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管。 3、其他 擦镜纸，香柏油、二甲苯、凡士林等。 四、操作步骤 采用悬滴法，具体步骤如下： 1、制备菌液 在幼龄菌斜面上，滴加 1~2mL 无菌水，制成轻度混浊的菌悬