3、染色玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）结晶紫染色液 (或石炭酸复红液)于茵膜部位，染1-2min。 4、水洗倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的 水中无染色液的颜色时为止。 5、干燥自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分（注意勿擦去菌体）。 6、镜检用油镜观察并绘出细菌形态图。 7、清理实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗，晾干后 备用。 五、注意事项 1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 2、挑菌量易少，涂片宜薄，过厚则不易观察
3、染色 玻片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为度）结晶紫染色液 （或石炭酸复红液）于菌膜部位，染 1~2min。 4、水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自玻片一端轻轻冲洗，至流下的 水中无染色液的颜色时为止。 5、干燥 自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分（注意勿擦去菌体）。 6、镜检 用油镜观察并绘出细菌形态图。 7、清理 实验完毕，擦净显微镜。有菌的玻片置消毒缸中，清洗，晾干后 备用。 五、注意事项 1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 2、挑菌量易少，涂片宜薄，过厚则不易观察
实验三细菌的革兰氏染色 一、目的要求 1、了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色的方法 2、学会用革兰氏染色鉴别细菌。 二、实验原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gam所创立的。革兰氏染色法 可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G)和革兰氏阴性菌(G)两大类，是 细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染：再加媒染剂一碘液，以增 加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物： 然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色：最后用番红复染。凡细菌不被脱色而保留初 染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色（红色〉 者为革兰氏阴性菌。 该染色法所以能将细菌分为G~菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成 分的不同所决定的。G一菌的细胞壁中含有较多易被乙醇容解的类脂质，而日肽 聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的 通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后 就成红色。G菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理 后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 l、菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subrilis) 2、仪器显微镜。 3、染色液草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lug0l)碘液，95%乙醇，0.5% 番红染色液。 4、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。 四、操作步骤 1、涂片 ()常规涂片法加一滴蒸馏水于载玻片上，再用接种环挑取少量的大肠 杆菌和枯草杆菌与玻片上的水滴混合均匀，并涂成薄的菌膜（注意挑取枯草杆菌 的量应少于大肠杆菌)。 (2)“三区”涂片法在玻片的左、右端各加1滴水，用无菌接种环挑少量 枯草杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片 的中央。再用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合成仅有大肠杆菌
实验三 细菌的革兰氏染色 一、目的要求 1、了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色的方法。 2、学会用革兰氏染色鉴别细菌。 二、实验原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 C. Gram 所创立的。革兰氏染色法 可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G －）两大类，是 细菌学上最常用的鉴别性染色法。 革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂—碘液，以增 加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物； 然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色；最后用番红复染。凡细菌不被脱色而保留初 染剂的颜色（紫色）者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色（红色） 者为革兰氏阴性菌。 该染色法所以能将细菌分为 G －菌和 G+菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成 分的不同所决定的。G －菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽 聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的 通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后 就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理 后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli ）、枯草杆菌（Bacillus subtilis ） 2、仪器 显微镜。 3、染色液 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5% 番红染色液。 4、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。 四、操作步骤 1、涂片 （l）常规涂片法 加一滴蒸馏水于载玻片上，再用接种环挑取少量的大肠 杆菌和枯草杆菌与玻片上的水滴混合均匀，并涂成薄的菌膜（注意挑取枯草杆菌 的量应少于大肠杆菌）。 （2）“三区”涂片法 在玻片的左、右端各加 l 滴水，用无菌接种环挑少量 枯草杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片 的中央。再用无菌的接种环挑少量大肠杆菌与右边水滴充分混合成仅有大肠杆菌
的区域，并将少量大肠杆菌液延伸至玻片中央，与枯草杆菌相混合成含有两种菌 的混合区。 2、固定涂片在空气中干燥。手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在 微火上通过3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。冷却后，再加染料。 3、染色 (1)初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸按结晶紫染色液（加量以盖满 菌膜为度)，染色1~2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 (2)媒染滴加路哥氏碘液，染1~2min,水洗。 (3)脱色滴加95%乙醇，脱色20~25s立即水洗，以终止脱色。 (4)复染滴加番红，染色2~3min,水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。 4、镜检用油镜观察，并判断菌体的染色反应性。 5、实验完毕后处理 (1)清洁显微镜。 (2)染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干后备用。 五、注意事项 1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被 脱色而被误认为是革兰氏阴性菌：如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是 革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用 量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用己知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一 张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。 2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免 染色液被稀释而影响染色效果。 3、选用培养16~24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老、由于菌体死亡或自溶 常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应
的区域，并将少量大肠杆菌液延伸至玻片中央，与枯草杆菌相混合成含有两种菌 的混合区。 2、固定 涂片在空气中干燥。手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在 微火上通过 3 次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。冷却后，再加染料。 3、染色 （1）初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸按结晶紫染色液（加量以盖满 菌膜为度），染色 1～2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 （2）媒染 滴加路哥氏碘液，染 1～2min，水洗。 （3）脱色 滴加 95%乙醇，脱色 20～25s 立即水洗，以终止脱色。 （4）复染 滴加番红，染色 2～3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。 4、镜检 用油镜观察，并判断菌体的染色反应性。 5、实验完毕后处理 （1）清洁显微镜。 （2）染色玻片 用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干后备用。 五、注意事项 1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被 脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是 革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用 量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一 张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。 2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免 染色液被稀释而影响染色效果。 3、选用培养 16～24h 菌龄的细菌为宜。若菌龄太老、由于菌体死亡或自溶 常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应
实验四 细菌的芽孢染色 一、目的要求 1、了解芽孢染色的原理，并掌握芽孢染色的方法。 2、学会观察芽孢的形态特征及着生部位。 二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使 菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以 染色，而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同 一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体 脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染 料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢 便于观察。 三、实验器材 1、菌种巨大芽孢菌(Bacillus megaterium入、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。 2、试剂5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。 3、器m小试管(75mm×10mm)、烧杯(300mL)、滴管。 4、仪器显微镜 5、其他玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子等。 四、操作步骤 I、改良的Schaefler和Fulton氏染色法 (1)制备菌液加1~2滴水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2~3环的 菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。 (2)加染色液加5%孔雀绿水溶液2~3滴于小试管中，用接种环搅拌使 染料与菌液充分混合。 (3)加热将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15-30min。 (4)涂片用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜， 晾干。 (5)固定将涂片通过微火3次。 (6)脱色用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 (7)复染加番红水溶液，染2~3mim后，倾去染色液，不用水洗，直接用
实验四 细菌的芽孢染色 一、目的要求 1、了解芽孢染色的原理，并掌握芽孢染色的方法。 2、学会观察芽孢的形态特征及着生部位。 二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使 菌体着色而芽胞不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢既难以 染色，而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同 一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体 脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染 料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢， 便于观察。 三、实验器材 1、菌种 巨大芽孢菌（Bacillus megaterium ）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）。 2、试剂 5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。 3、器皿 小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管。 4、仪器 显微镜 5、其他 玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子等。 四、操作步骤 1、改良的 SchaefIer 和 Fulton 氏染色法 （1）制备菌液 加 1~2 滴水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2~3 环的 菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。 （2）加染色液 加 5%孔雀绿水溶液 2~3 滴于小试管中，用接种环搅拌使 染料与菌液充分混合。 （3）加热 将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热 15~30min。 （4）涂片 用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，涂成薄膜， 晾干。 （5）固定 将涂片通过微火 3 次。 （6）脱色 用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 （7）复染 加番红水溶液，染 2~3min 后，倾去染色液，不用水洗，直接用
吸水纸吸干。 (8)镜检用油镜观察。 结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色 2、Schaeffer与Fulton氏染色法 (1)涂片按常规法制一薄涂片。 (2)固定在微火上通过23次。 (3)染色 ①加染色液加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将 涂片放在玻片搁架上，再将搁架放在三角铁架上，用微火加热至染料冒蒸汽时开 始计算时间，约维持l5min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。 ②水洗待玻片冷却后，用洗瓶中的水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色 液为止。 ③复染用番红液染色2mim (4)水洗、吸干。 (5)镜检用油镜观察。 结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。 五、注意事项 1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。巨大芽孢杆菌在37℃培养12~14h的 效果最佳。 2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优 越，可优先使用。 3、用改良法时、欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试 管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于 管底，涂片时菌体太少
吸水纸吸干。 （8）镜检 用油镜观察。 结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。 2、Schaeffer 与 Fulton 氏染色法 （l）涂片 按常规法制一薄涂片。 （2）固定 在微火上通过 2~3 次。 （3）染色 ①加染色液 加 5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将 涂片放在玻片搁架上，再将搁架放在三角铁架上，用微火加热至染料冒蒸汽时开 始计算时间，约维持 15min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。 ②水洗 待玻片冷却后，用洗瓶中的水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色 液为止。 ③复染 用番红液染色 2min。 （4）水洗、吸干。 （5）镜检 用油镜观察。 结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。 五、注意事项 1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄。巨大芽孢杆菌在 37℃培养 12~14h 的 效果最佳。 2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂片法优 越，可优先使用。 3、用改良法时、欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试 管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于 管底，涂片时菌体太少